有谁能帮帮我？怎么从外周血提取培养T细胞和NK细胞

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外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细胞的重要来源。其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分 离法、Ficoll分离法。
. u3 Q  k2 \0 k5 R" ^1、自然沉降法：
4 _% ?2 d( @3 I) r4 T将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞，下层主 要为红细胞。此方法简便但各层中的细胞种类多，不纯。血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和少量红细胞。下层虽以红细胞为主，但 也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。 0 p4 M& z, @1 q8 g# |
2、差异沉降法：
5 C0 ?* p" d3 G8 p$ h, N用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细 胞分离开。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两者易于分离开， 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。此法 分离的细胞纯度也不高。 4 H  d" e! O3 x0 P3 i$ ~# u
3、氯化铵分离法：
6 ^% d2 u- ]! W/ E8 h/ g" A' E0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂 解，以排除红细胞的干扰。另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。方法如下： * p: d1 M3 k& [! g! D0 M
将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min离心20min，吸出上清血浆，将下层的红细胞、白细胞混合后，加入0.83 氯化铵，用量为血细胞悬液液量的3倍，于4℃作用20min后离心弃去上清。 0 ?; b6 Y/ G( J6 b% x
在沉淀层中再加入新鲜0.83氯化铵混匀后于4℃作用20min，以便彻底清除红细胞，离心弃上清。 0 D# J0 f. G6 [- j2 E& i
收货下层的细胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉霉素）培养基制成悬液，调整细胞浓度为（8-10）x10^9个/L，分瓶加塞在 37℃普通培养箱中旋转培养（12r/h）。
8 }9 l7 E* q% c% @' G/ F混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F）诱导22h，收货上清就可生产白细胞干扰素。此法分离的细胞纯度更差。
* r, w1 ~% R+ ^0 q! i2 ]6 W$ _4、Ficoll分离法：
* O+ R0 @7 x2 i# o4 L  n$ X7 b# u采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同相对密度分离开，如分离淋巴细胞可选用相对密度 1.077的分离液；若分离血小板可用相对密度1.090的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度1.120的分离液，现以淋巴细胞分离为例，方法 如下。
1 d  _: M7 d& v# R* j' i取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液，用无钙、镁离子的PBS稀释3-4倍。 0 z( K7 c9 I% C
将Ficoll淋巴细胞分离液事先分装于离心管中，使其沉于管底，并在37℃中预热。
. ]( _+ R0 Y2 n, p用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入，不让细胞悬液冲破分层液界面，使其悬于分层液上方。 9 p7 c! w! ~. g% z) h1 A% H, g5 M
以2000r/min离心20min后，不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上，由于红细胞在Ficoll作用下成串下沉，故在离心管中分布在Ficoll层下方，淋巴细胞分布在Ficoll层上方。
0 P% h2 h! l) T  J) Y! T 收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
+ `4 J$ D% h, i! G; m5 K5 n  `; ~此法分离获得淋巴细胞纯度高。
& c' u. E& P( Y  A( p% W4 Y5 b分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份 混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。若配制高相对密度的分离液用加入高浓度 泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll来调整。
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