应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞

zarecol

抛砖引玉，酶解法和机械法均可获得比较理想的原代细胞（各大文献中方法都很详细，也很到位请各位查阅，在此不做解释），但怎样保持细胞状态常常是我们在实验室培养工作中的难题，稍有不慎细胞就会出现各种问题，有时让还真让我们头痛。
+ l* Q* ]5 t' L% U3 T常常看到很多回帖的仁兄发表细胞养到10代20代仍然保持良好的形态，心中十分羡慕，所以发表本帖也是有感而生。
+ {; p% d# x' y4 Q0 v- O2 S首先献上我的经验之谈，希望我们能共同探讨，相互学习。脐带间充质干细胞培养，分离方法有酶解法和机械法，两者获得的细胞状态都差不多，机械法的细胞较好，对细胞损伤小，但缺点是时间长几天，不过个人感觉利大于弊。所以我推荐采用机械法分离获得原代细胞。这个步骤的关键我认为是速度，为什么这么说呢？原因在于所用脐带的离体时间和开始分离到培养液接触组织块的时间决定了原代密度达到80%融合所需要的时间。培养液的选取也很重要，DMEM和DMEM/F12的培养液作为基础培养液都是不错的选择，血清建议采用进口血清浓度10%。传代时采用0.25%胰酶37摄氏度进行消化，终止消化采用等量血清。4 `. O* P- y5 [4 ]# w$ z: a
以上是我培养细胞时采用的方法，但并不能每次都获得形态良好的细胞，这是我的问题所在。! s: R  }5 t% w3 s4 q- G
细胞形态保持3代左右的长梭形，之后细胞开始向扁平状发展，而且培养液变黄的很快。希望大家能给予我这方面的帮助。谢谢。0 q1 _$ I; `  ~" Y0 V4 a3 C. k

shashou_com

“传代时采用0.25%胰酶37摄氏度进行消化，终止消化采用等量血清。”6 a7 ^+ L* f% c( W% k- H( o
用酶消化法消化细胞时，必须随时在显微镜下观察细胞被消化情况 ，若细胞质回缩，细胞间隙
2 i; @! L; f1 Z) ^; g增大或有个别细胞漂浮起来时，立即吸掉消化液，加入含血清培养基，终止消化。

sdwzg119

样脐带MSC大约有一年了，脐带总有个差不多几十了吧，谈谈一点心得：
. F  I3 a7 n( W' c8 V4 Q% w一直用贴壁法样脐带MSC没对比过酶消化法，不过总体上感觉贴壁法还是挺不错的，得到细胞的时间和质量大体上能算稳定。4 {9 i6 \# Y3 W, c) h, q( s
培养得到的脐带MSC的确是有好有坏，刨除操作等人为的原因，我个人认为脐带本身之间是有很大的差别的，不光是状态和生长速度及能传的代数，连流式结果都相差甚远。当然，技术好的人能比别人养的好，我曾经一个细胞培养到20多代，细胞状态仍然和原代形态差不多，但是大多数时候也就养到10代就状态不好了。
/ Q0 L. b1 a" f( U* H) P3 @% L  h+ j还有就是养细胞一定不能太懒，不能等细胞长的十分满以后再传代，哪样很容易老化，也不能传代的时候为了省事传的很稀，哪样也不好，有人说应该前几代高密度，后面低密度。# S5 \7 \  R$ H( E8 ?! q7 |
总之我的经验是不但方法要对，态度也要端正，要小心翼翼的伺候细胞，有时候感觉养这玩意比伺候爹娘和媳妇都费劲....................' [- U7 s6 o4 M5 X$ P/ ]" L7 n3 d

( v0 q: Q4 m/ J" l! k0 T/ B- n还有楼上说的培养基变黄很快，我感觉要么你是污染了，要么你就是培养基PH平衡系统不好。干细胞要是等到培养基变色了哪还怎么活啊！哪么娇贵的东西。

manycells

同意楼上的。PH的平衡系统还是需要好好调整

ditiger

个人认为胰酶浓度也很重要，0.25%太大，细胞在半分钟内就能消化下来，而且非常容易消化过，导致细胞成团，或老化，我们一般用0.05%，效果挺好。

xbqian

我们采用低浓度的胰酶、胶原酶及透明质酸酶三种混合酶过夜消化去除血管的脐带，效果挺好了，一般十几个小时消化效果较好，而且终止消化的时间要求不是那么高，下游的传代培养效果也不错，技术稳定。我觉得大家可以试试。

zarecol

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7 n, k' \5 f  k' G9 A0 i' y消化终止点怎样确定呢？细胞长到多少密度的时候传代最好呢？

sdwzg119

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针对消化来说：我个人感觉一直在显微镜下观察为好，一直看到细胞回缩明显，轻轻拍拍细胞就会悬起来，但是这也是经验之说，细胞之间是有差异的，总之我现在的做法是尽量短，即使是放入培养箱37℃消化也是1分钟拿出来看一眼，确保没有消化过头。我用0.05%的胰酶，一般多数拿到显微镜下消化就差不多了，在有就是放入培养箱1分钟，最多消化3分钟。
' P* K7 C2 m7 L1 ~. r+ c传代据说80%最好，可是这谁能控制的住细胞的长势呢！！！经常今天看着不到80%，明天就长过了！头疼！一直头疼！# @3 D, [5 P3 N

zarecol

回复 sdwzg119 的帖子7 h3 V( d% _, W, p1 _  f0 ?

1 ?( ^$ F" d. `' b谢谢！

lazyworm

我们虽然培养过程中会出现一些小的问题，但是总的来说组织块贴壁法是比较稳定的，我们的消化浓度是0.125%，消化时间因人员熟练程度而不同，有时候有人都超过了7分钟，但是细胞好像还是挺好的。当然这可能会对后续的传代有影响。0.05%的浓度还这么快，有机会试一下。