PCR 检测支原体

lingminliang

哪位做过PCR检测支原体，请赐教具体步骤  ，谢谢

huahua2008

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. e" @8 o4 c/ R# R1 @  q5 b. ?. |) y& D% j" a3 E8 A* d& w
有可检测支原体的试剂盒，上面的步骤很详细，祝你好运！

牙牙丫丫123

PCR检测支原体方法如下：& r0 ^! Y2 ~* e4 x4 |7 H
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。请注意：待检细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。2 M* z5 K* C; a- r# _5 T  k" a& w  l
2、将盛有100ul待检培养液的1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热5min。请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）" |/ f: r+ E# I
3、高速离心，13200rpm，1min。
2 I3 X* L3 L, k) l' f8 A; _4、配制PCR反应体系：
2 X$ m4 ]; o- E# h2 v3 M2 w1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。# h8 S6 Y1 W9 P  l# Z! _
2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。( R4 F7 C7 E8 d, R& S& T9 L
3）PCR反应体系：0 P7 S6 c: y, o1 r6 y0 u
H2O（灭菌超纯水） 13 ul, Q. ~. j1 d8 W: B: y- a
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul3 e% ]% u# }% S" @2 J
dNTP 0.8 ul/ S' [3 e" S+ Q, t5 }; c
Primer(+) (10uM) 0.5 ul
+ _2 \4 q( s! S! ?( sPrimer(-)(10uM) 0.5 ul
8 t  {# O. S% v, ]- T+ QPolymerase 0.2 ul
# l" C! \* H# wSample 3 ul# w0 `2 O! C/ R  ^1 j
4) PCR反应程序：" `- |2 y& W; B' ~8 X7 Y& g: b
94℃ 2min
& h. E$ s+ {7 [3 N, N94℃ 30sec: l  Z! L5 t! K
55℃ 30sec
9 d& B  N4 ]2 _: \72℃ 20sec# ?$ T! n  x) [7 p
GOTO step 2 , 36 times  h$ p' [8 a+ Y* x/ S. T
72℃ 7min3 M  X/ K% Y! G4 ?8 {
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。
' j. j6 u& B+ u: K& l% g8 D6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。
" l0 Y4 C7 k5 G引物序列：3 O- I. B2 A, X8 s
Primer(+)：5’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’
! ^4 }: R8 k5 ^) |- x  ^Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’

初学者

楼上回答的很详细啊