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PCR检测支原体方法如下：! Z, u* y- r3 Z1 |. i! U) ~
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。请注意：待检细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。9 Y) ]* D$ w8 m* R; `- p
2、将盛有100ul待检培养液的1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热5min。请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）9 h2 V% ^% i9 R7 K5 G
3、高速离心，13200rpm，1min。
3 h7 M% y- D& u9 \3 A; O- C f2 |" a4、配制PCR反应体系：
) T9 n( s' }( F5 @# }8 v8 S1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。
1 ?3 E1 Z% ~& Q/ X- }% d2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。
9 H- D5 x5 Z% C1 Q! s+ M3）PCR反应体系：
; B0 o! h+ [1 X4 [, |H2O（灭菌超纯水） 13 ul
! N, B8 ^! d4 s: Z p0 V0 SBuffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
2 ]* ]: {! u6 v: X( Q" N% S# h, [ ldNTP 0.8 ul* U, a0 h* G6 x) `3 r3 o6 F
Primer(+) (10uM) 0.5 ul
0 c( ]: p0 R% APrimer(-)(10uM) 0.5 ul
6 A, T3 x# b* zPolymerase 0.2 ul# ~) M$ V% u- R, d' k
Sample 3 ul
) |! ~' ~3 L+ f! Q/ T8 l4) PCR反应程序：
6 J D9 |" ?& F0 T94℃ 2min+ h$ b o. J0 s5 _
94℃ 30sec5 R9 S4 e9 ~! U5 X
55℃ 30sec: U# J( _% \) q8 f- q2 G# \& h
72℃ 20sec
1 U1 q& e& N$ e7 \! NGOTO step 2 , 36 times
1 O9 v* x; T# f) Z72℃ 7min
8 l" w. _* R, |- l' n7 A& Q5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。
# h+ l/ I) b3 b7 o! p0 L6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。6 H* T3 B( c1 h
引物序列：
8 b$ m5 ]1 N, m v8 }8 G5 ]. cPrimer(+)：5’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’
6 i7 ~: A$ K# T$ m: _Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’ |
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发表于 2012-2-23 18:53
