关于构建microRNA过表达质粒的问题

iamxuchen

最近想构建microRNA的过表达质粒，转入ES细胞看效果，各位请问用什么质粒载体较好？带GFP的还是pCDNA3.1好？我可能做好几个，直接把前体序列PCR出来插入就可以了吧？

iamxuchen

还有一个问题就是克隆出的pri-mir片段需要加上ATG的序列吗

chenzhongyan

哪位大侠赐教一下。我也打算做。现在一无所知

weiyepan

回复 iamxuchen 的帖子
/ h$ V$ B4 I3 L) u, x9 B  m- B; R( b( I
不用ATG的，你需要哪种miRNA，如果是人的话好多公司都有全套的，例如复能基因，你可以打个电话去问一下，那里好像自己也有载体，带GFP的也有。

xiphias

请看2004年一篇science 的文章。
# ?0 q, @! f* h. P4 FMicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation( m& s4 K. f! Z

8 }2 D) N8 _6 g+ z/ h( f% H只克隆前体序列是不会表达miR的。3 f; s. [# [3 k6 r, B- c
不需要ATG。7 X( x( p1 c* {3 a* B1 b% J! l
个人觉得有GFP，或者抗性会好点。

xiphias

回复 xiphias 的帖子# j8 L4 @" y9 Q$ {, h/ O

% O8 v" N( |5 | microRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation..pdf (1.27 MB)

2012-4-13 17:41 上传

请用IE浏览器下载
miR表达
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

% L6 h: ]. h9 P* B) l7 f6 G

' K5 G" B4 R9 }  R8 kAll constructs with at least 40 nt on each side of the 67-nt hairpin were efficiently processed into
" f* m) o8 a7 m. S  y  pthe mature miRNA (Fig. 3B)

jkfly

我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

iamxuchen

jkfly 发表于 2012-4-13 18:19
3 H& b6 M/ }) q# X8 P1 m6 `我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

7 V! a$ v. V. o1 Z- m追问下，我自己做的pcDNA3.1过表达感觉效率不是很高（293里面），也就8倍多点，听别人说用T7启动子的会好很多？

茅草无敌

我也想问问就是构建pEGFP载体到底需不需要将atg放进去啊？

86964109

miRNA构建是不是U6或H1效率高啊