关于构建microRNA过表达质粒的问题

iamxuchen

最近想构建microRNA的过表达质粒，转入ES细胞看效果，各位请问用什么质粒载体较好？带GFP的还是pCDNA3.1好？我可能做好几个，直接把前体序列PCR出来插入就可以了吧？

iamxuchen

还有一个问题就是克隆出的pri-mir片段需要加上ATG的序列吗

chenzhongyan

哪位大侠赐教一下。我也打算做。现在一无所知

weiyepan

回复 iamxuchen 的帖子  K/ Z' Z% ?9 n8 V% y: W
( {! s8 v. F/ o$ {4 A
不用ATG的，你需要哪种miRNA，如果是人的话好多公司都有全套的，例如复能基因，你可以打个电话去问一下，那里好像自己也有载体，带GFP的也有。

xiphias

请看2004年一篇science 的文章。; j9 P# U& `- J! |0 g& s9 c1 j+ `
MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation
! W1 m% u- o9 D/ g6 ]6 ^9 T) ~
只克隆前体序列是不会表达miR的。
  j0 k/ S* n  i8 ^! \不需要ATG。9 C& y9 f, v1 J/ |* n
个人觉得有GFP，或者抗性会好点。

xiphias

回复 xiphias 的帖子. e% m9 h7 F( w! H& f3 S

/ N) l5 E# B- B( G microRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation..pdf (1.27 MB)

2012-4-13 17:41 上传

请用IE浏览器下载
miR表达
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

6 ~& J5 l0 ^$ G$ H# k) ~. y9 P
5 K& v  Y! o+ l7 u$ p7 Y: QAll constructs with at least 40 nt on each side of the 67-nt hairpin were efficiently processed into
: s' j5 s2 h8 i( _the mature miRNA (Fig. 3B)

jkfly

我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

iamxuchen

jkfly 发表于 2012-4-13 18:19
2 W% |$ I2 s7 v  m# U我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

# |9 e- L! h" \, C. \4 j  c# V# Z" ]
追问下，我自己做的pcDNA3.1过表达感觉效率不是很高（293里面），也就8倍多点，听别人说用T7启动子的会好很多？

茅草无敌

我也想问问就是构建pEGFP载体到底需不需要将atg放进去啊？

86964109

miRNA构建是不是U6或H1效率高啊