请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

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我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

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$ h. R8 q! h+ Q9 n6 Y$ L) Z- [: I' K我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。  D% L0 y; S, ~6 C! K
我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。3 `( U6 U) q& A) i6 d& Y* E$ B
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。3 i+ G) Y7 Y! P! M  }5 ~. t
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。% I8 ?  B- J- Z' ]& d. H' d
请问你是怎么做的，结果怎么样？
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4 {# A- Q; T. a是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

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请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？/ G5 O8 S- |5 l0 ?% o3 l' `
2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？