请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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  S3 y. V# m9 C1 s3 O  `# A/ k6 t5 |' y+ i4 |: U
请问是哪三种酶啊？

细胞干

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. w; y+ Y6 s/ B
2 ?8 D6 p' ^( W+ Y# S0 e  a我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。* O+ ~! B' n/ a8 D# \- t8 r
我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
7 L" j: I7 b& X$ w  ~消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
7 _( B  x2 z" h" x3 o6 N但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
- k. m( E+ G: Q( e! n请问你是怎么做的，结果怎么样？
; e0 P! ^6 E) a5 T/ Z  Y  l

细胞干

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5 Q$ E& m# P$ f8 J
是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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7 q7 c' s( D2 W, i" _, S" ~+ S* S
0 V! O4 `, u3 V$ V5 c/ {# E8 {3 C 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法; v( Z  P* j  E5 t* h, w- ~2 _

, e  A/ `5 s/ k3 ?) U) H$ r4 OWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
; i( s% k# A$ f6 G: q/ {小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h3 O* B% Y+ U3 w/ w6 O% c
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
0 {/ N0 w4 k8 n+ D+ {) W/ N胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
: r2 _. k3 |% S    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理303 X1 n8 y; H# P  x3 b
分钟，轻轻摇动。
. T1 \- e4 b5 ~. R* f    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
! k6 w* P  \9 o; G/ O" N) c    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
+ g8 R5 H4 A4 k! q0 k    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少! g! W$ x. e  C  L( B! I
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在  }5 D1 q& H) Z$ D$ U5 M8 V
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养." U6 O( p! q$ }

5 j, M# p+ V/ s& F4 a# \  e     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉8 W$ R8 l6 {* w* [

上官冰梦

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6 o  [" q) ~  L6 n. ]5 n
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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, x5 l$ T& [$ b3 X( p% N1 p; x+ Q) R+ W) L- q8 v: y
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
9 G2 Z8 J% e- `  H6 X& U2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？