请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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/ P& T# O1 A3 D" c3 W& ^- {
请问是哪三种酶啊？

细胞干

回复 yingjie 的帖子4 {. r/ R6 H6 _
" a* F8 Z' I$ `; q0 O, C2 H
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
  A) P- v0 M3 _% q我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。; x9 r5 k5 o2 r+ G2 P/ h
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
: [- C; Z6 R+ i% j# E2 I! c& t; S但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。9 m8 P' H$ D' z8 ]: P2 b
请问你是怎么做的，结果怎么样？
3 ]3 j: V  }# W5 b

细胞干

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, ~# {) `' [/ o5 R2 ?是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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: P( `' f# w6 m* d/ \
/ Q) B. a$ Q- r 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
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8 i7 m+ ^( b/ j* j. SWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
; e0 Z6 G; ]3 C+ v1 V" {2 u4 v小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h
. F- L% y3 X0 a    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是; ]$ R) a  ^' ]
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
3 Q/ Y, u0 ?: U" E* l. i) ~& J) z    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30' f2 N/ @7 H7 y7 l
分钟，轻轻摇动。0 q3 q5 f& H. C
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。& E8 Q6 ]1 p9 V2 F
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.4 ?4 D$ Q7 `8 n, n% [# M# d8 k' [
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
' k$ \, ]2 h4 I6 H7 r, c- n' m  ]许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在* K4 T5 z  d3 G1 [4 X: D7 Y
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
6 R% H/ R) n" c* n: {5 g
; c; Q* G7 d  q8 B; b     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
0 m5 f" l' J/ q) c) M

上官冰梦

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* b& i9 f6 F- b: L( s: o为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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3 D, g; i8 t! w+ R' y, _' e" p
# O! s- S# v* F/ i3 z8 d  X+ M请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
$ H1 o5 Q. `3 x) r8 i4 G2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？