PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

hndxws

既然你要试，那你就试吧，长点经验也好。

ying

回复 hndxws 的帖子
* h. U. v9 B3 N% l" g( W  j; x! y# H. l/ P, }. t3 z5 e
非常感谢！另外感谢楼上诸位！我想我先按照楼上试试，搞不定再换引物吧～毕竟订引物比较麻烦，手边能作的努力先试试。

ying

我是从质粒P，不是从基因组。要克隆到另一个载体上的。位置都定好了不能换的，引物只能这样，引物就是最两端的序列。没法换引物，只能改变其长度。我的引物其CG比例都正常的。

hndxws

上面几楼回复的都有道理，但是我个人觉得都不是出现这问题的重点，如果不信楼主可以按他们的建议试试，看是否会有改进。我觉得进你目前提供的信息，最可能出现问题的是你的引物。( t+ H8 M5 w) o; u
PCR反应，如果实际都是好用的话，主要的就是模板和引物。在你这里主要是引物出问题了。具体来说是你forward的引物退火温度太低，我用软件看了一下，只有40度多一点，这样的引物在你的条件下是不太可能有条带的，而reverse引物的退火温度就可以。所以你的问题是引物不合适导致退火温度不合适，PCR不能有条带。
8 B( ~2 z1 Y+ G我们很多同仁，都觉得PCR简单，但是真正对PCR条件有理解的却在少数，大家都是嚷着，引物长度多少到多少，退火温度什么加减5度，太机械，我从来没有按什么加减5度做实验。最主要的就是引物实际的退火温度。在你的引物里，第一个长度虽有26，但是退火温度还没达到你设定的条件，第二个虽然24但是已经达到你的退火条件，PCR退火条件同时也不能设太低，低于43度的话，会因自由能低，一样不成功。  `1 P. z# C6 b# P+ }
我的建议是把你的第一条引物换掉，在原有的基础上再加5个碱基，即attgattattgactagttattaatagtaatc，把退火温度设到55，一般的质粒模板，这个条件绝对没问题。你试试，希望把结果告诉大家。

zxcv12345

回复 ying 的帖子6 P9 H4 n' L$ l7 \

9 s; }; y8 ]! R& ~& Y1 B; [3 S很正常的。
: e$ G* D6 k$ t1 y2 N
: f2 x4 @% c* f7 ^. B: Kpromoter的GC含量高。DMSO条件可达20%。
* ~8 x6 [! I" C- Q  u7 H  h3 X/ X1 z$ s7 D, J" S
Takara也有专门针对高GC的试剂盒, 用起来还可以。6 F  g' C4 X9 v5 E5 s
" p& G* y3 a* X/ e
另外，一定要确定质粒没问题。去年我PCR扩增质粒，做了一个月，什么条件都試了，最后测序发现对方给的质粒错了，

sykbod

手边没软件就没对你的引物，想来做了那么多引物应该没问题。  ]6 z% @6 i7 c% f, ?, x" k4 h
一般这种情况我加DMSO了 退火时间给1min
4 v- M) d, d; A9 f局部超过90%应该也会有条带不会很干净，除非你两个引物刚开始p就进入高CG区。不加DMSO的话曾经做出来过72度退火才有条带的（两步法很好用 真的）。加了之后减5-10度都可以。具体看模板了。
' ~  H' X1 I) Q! G$ g& H8 H$ U话说做一个梯度不就完事了