干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

 

 

搜索
朗日生物

免疫细胞治疗专区

欢迎关注干细胞微信公众号

  
查看: 13071|回复: 1
go

[请教] 多段连的克隆 [复制链接]

Rank: 2

积分
174 
威望
174  
包包
499  
楼主
发表于 2012-4-16 20:52 |显示全部帖子
首先,不太明白的是,你说的“PCR来搭桥”是什么意思?
& n" l8 {& j2 `" ~* C; |' J1 f/ |
! Z. L, _& p+ H  t/ J! ^然后,最近我也做了一个与你相似的工作,是将三个外源片段连接到一个载体上。你上述所说的也是我在做的过程中的一种方案。
& R- I2 A) F3 h! X) X: d很明显,这个方案在理论上是完全木有问题的。由于多片段的连接在一步步的产物酶切、纯化过程中的损失和多次连接的低效率,给这样的工作带来不小的麻烦。理论上只要有一分子的四片段连接存在,用PCR扩增就能得到大量的四片段,然后连接到目的载体上。+ q, U. z) n" Y# ^: r1 y( P8 F
然后,要做PCR,至少得保证那个一分子的四片段的存在!!也就是说,在各个内切酶的双酶切时都能切开!然后都能连接起来,得到少量的四片段。+ h+ N; Z( r: l! N! m2 l  i! J
其次,PCR扩增的时候,可能引物不能将就原来的片段1正向和片段4的反向了。因为你之前设计引物的时候应该没有考虑这四片段的总序列。这样即两个引物的Tm可以将就,中途出先错配的几率也是很大的。
1 l( m1 ?1 J$ m( ~其次,PCR长片段Tap酶的选择,应该注意。既要考虑到长片段的扩增能力,也要照顾你提到的保真性的问题。" K. r0 z% x2 A& b

1 K! s4 K! {, L- T3 u' u* Q还有,你是觉得这个方案能够减少序列中碱基突变的可能吗?但像这样的话每个片段也是经过了两次PCR,而且在最后一次4.8Kb的扩增中突变几率也该相对变大,除了在材料如保真酶等的选择上下点功夫,这个方案本身肿么会减少突变的几率?/ {# \6 l  a8 L( K% C' C9 x
) p$ n, \0 V" L2 k
期待交流
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 20 + 30 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 20  包包 + 30   查看全部评分

Rank: 2

积分
174 
威望
174  
包包
499  
沙发
发表于 2012-4-17 10:14 |显示全部帖子
7 p# I  b# p9 Z, T) M5 H- ]) V
说不上指导啦……; W% S9 y7 m3 F. j- S1 Q: ~5 p
7 U0 |. G6 {9 n* v# G$ S* Z
老实说,虽然这个方案理论上木有问题,也作为主行方案之一。但由于当时用的Taq酶没有扩增出我的“三片段”,所以实验结果并不是按照这个方案做出来的。而是最直接的,先连接三片段,再加入载体连接,然后转化,居然得到了重组子……之后换了Taq后,也扩增出了“三片段”,但那时已经到重组子筛选了,就没有顺着这个方案再继续做了。
7 {5 w  ~" ?, P6 F. |当然,你要连接四个片段,难度肯定大多了。但依然建议在你在做这个方案的同时,可以将那个最直接的最笨的“连接、连接、转化”的方案同时进行,当然,成功的几率很小,要是仔细算还有点浪费材料。但那个方案是比较省时间的,要是能运气好直接就做出来,就不用一步一步PCR纯化、酶切、纯化、连接……
! d3 A7 f* m/ w' ^还有,要是直接将4个片段连接,不容易得到“四片段”的话,可以试着先得到“两片段”或“三片段”
5 c) r0 s3 X( W7 K# q' F! ?* |2 V7 j# G
祝实验早日成功~!
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 20 + 30 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 20  包包 + 30   查看全部评分

‹ 上一主题|下一主题
你需要登录后才可以回帖 登录 | 注册
验证问答 换一个

Archiver|干细胞之家 ( 吉ICP备2021004615号-3 )

GMT+8, 2025-6-10 13:39

Powered by Discuz! X1.5

© 2001-2010 Comsenz Inc.