多段连的克隆

LQAI2012

首先，不太明白的是，你说的“PCR来搭桥”是什么意思？6 r2 [. ]4 n- \9 j

( P- n4 @; F+ o4 Q然后，最近我也做了一个与你相似的工作，是将三个外源片段连接到一个载体上。你上述所说的也是我在做的过程中的一种方案。+ d) b, J; F7 ^0 n0 {
很明显，这个方案在理论上是完全木有问题的。由于多片段的连接在一步步的产物酶切、纯化过程中的损失和多次连接的低效率，给这样的工作带来不小的麻烦。理论上只要有一分子的四片段连接存在，用PCR扩增就能得到大量的四片段，然后连接到目的载体上。( n& D& v" |3 z; b6 W
然后，要做PCR，至少得保证那个一分子的四片段的存在！！也就是说，在各个内切酶的双酶切时都能切开！然后都能连接起来，得到少量的四片段。
/ a. l& f, G  u4 N' s/ D其次，PCR扩增的时候，可能引物不能将就原来的片段1正向和片段4的反向了。因为你之前设计引物的时候应该没有考虑这四片段的总序列。这样即两个引物的Tm可以将就，中途出先错配的几率也是很大的。! ?3 A* t% ]! U! r5 @6 m& i
其次，PCR长片段Tap酶的选择，应该注意。既要考虑到长片段的扩增能力，也要照顾你提到的保真性的问题。: U) W' p2 W9 [9 k0 Z+ Z. [2 S" V

- V  o7 `; k. I  R- `1 h8 U- }还有，你是觉得这个方案能够减少序列中碱基突变的可能吗？但像这样的话每个片段也是经过了两次PCR，而且在最后一次4.8Kb的扩增中突变几率也该相对变大，除了在材料如保真酶等的选择上下点功夫，这个方案本身肿么会减少突变的几率？
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期待交流

LQAI2012

3 R$ G$ V( f* x2 s0 C& c说不上指导啦……/ o: z, C& @. k

8 C4 G9 {! l6 _8 t! ~+ v老实说，虽然这个方案理论上木有问题，也作为主行方案之一。但由于当时用的Taq酶没有扩增出我的“三片段”，所以实验结果并不是按照这个方案做出来的。而是最直接的，先连接三片段，再加入载体连接，然后转化，居然得到了重组子……之后换了Taq后，也扩增出了“三片段”，但那时已经到重组子筛选了，就没有顺着这个方案再继续做了。
  O: I$ l4 {6 I, s  A: u: _9 w当然，你要连接四个片段，难度肯定大多了。但依然建议在你在做这个方案的同时，可以将那个最直接的最笨的“连接、连接、转化”的方案同时进行，当然，成功的几率很小，要是仔细算还有点浪费材料。但那个方案是比较省时间的，要是能运气好直接就做出来，就不用一步一步PCR纯化、酶切、纯化、连接……% i0 E: y' p- y: P
还有，要是直接将4个片段连接，不容易得到“四片段”的话，可以试着先得到“两片段”或“三片段”
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祝实验早日成功~！