
- 积分
- 174
- 威望
- 174
- 包包
- 499
|
首先,不太明白的是,你说的“PCR来搭桥”是什么意思?
& n" l8 {& j2 `" ~* C; |' J1 f/ |
! Z. L, _& p+ H t/ J! ^然后,最近我也做了一个与你相似的工作,是将三个外源片段连接到一个载体上。你上述所说的也是我在做的过程中的一种方案。
& R- I2 A) F3 h! X) X: d很明显,这个方案在理论上是完全木有问题的。由于多片段的连接在一步步的产物酶切、纯化过程中的损失和多次连接的低效率,给这样的工作带来不小的麻烦。理论上只要有一分子的四片段连接存在,用PCR扩增就能得到大量的四片段,然后连接到目的载体上。+ q, U. z) n" Y# ^: r1 y( P8 F
然后,要做PCR,至少得保证那个一分子的四片段的存在!!也就是说,在各个内切酶的双酶切时都能切开!然后都能连接起来,得到少量的四片段。+ h+ N; Z( r: l! N! m2 l i! J
其次,PCR扩增的时候,可能引物不能将就原来的片段1正向和片段4的反向了。因为你之前设计引物的时候应该没有考虑这四片段的总序列。这样即两个引物的Tm可以将就,中途出先错配的几率也是很大的。
1 l( m1 ?1 J$ m( ~其次,PCR长片段Tap酶的选择,应该注意。既要考虑到长片段的扩增能力,也要照顾你提到的保真性的问题。" K. r0 z% x2 A& b
1 K! s4 K! {, L- T3 u' u* Q还有,你是觉得这个方案能够减少序列中碱基突变的可能吗?但像这样的话每个片段也是经过了两次PCR,而且在最后一次4.8Kb的扩增中突变几率也该相对变大,除了在材料如保真酶等的选择上下点功夫,这个方案本身肿么会减少突变的几率?/ {# \6 l a8 L( K% C' C9 x
) p$ n, \0 V" L2 k
期待交流 |
-
总评分: 威望 + 20
包包 + 30
查看全部评分
|