多段连的克隆

ying

本人做一个比较复杂的克隆，设计如下策略：

ying

请教一下各位，可以这样子做吗？ 因为四个要插入的片段大小都在1.2K左右，合起来有4.8K，如果用PCR来搭桥，需要搭很多次，不想这样做，怕突变。所以就打算分别P出各个片段，然后回收以后再酶切，切出粘性末端，然后用T4连接酶来接上。因为考虑到效率不会很高，所以再进行一轮PCR扩增（用两端的引物），再酶切插入载体。这样相当于每个位置过了2次PCR，总轮数在60圈以下。（KOD-plus II）
) a" E  q' ]" s1 J) T/ U$ o! O不知各位有什么见解，这样做合理与否？

ying

图里面有个词拼错了，是用"CR using Ligation products as template",不是"produce".抱歉

LQAI2012

首先，不太明白的是，你说的“PCR来搭桥”是什么意思？' [+ U1 U% G: T- e$ V
/ [: a( G( @  U$ N
然后，最近我也做了一个与你相似的工作，是将三个外源片段连接到一个载体上。你上述所说的也是我在做的过程中的一种方案。
+ @$ B7 A" }2 b0 ^- J. K$ Q很明显，这个方案在理论上是完全木有问题的。由于多片段的连接在一步步的产物酶切、纯化过程中的损失和多次连接的低效率，给这样的工作带来不小的麻烦。理论上只要有一分子的四片段连接存在，用PCR扩增就能得到大量的四片段，然后连接到目的载体上。
# c* m- ]2 E$ K% X3 D  T; f然后，要做PCR，至少得保证那个一分子的四片段的存在！！也就是说，在各个内切酶的双酶切时都能切开！然后都能连接起来，得到少量的四片段。( P4 b+ O- W! G
其次，PCR扩增的时候，可能引物不能将就原来的片段1正向和片段4的反向了。因为你之前设计引物的时候应该没有考虑这四片段的总序列。这样即两个引物的Tm可以将就，中途出先错配的几率也是很大的。
. E# w' T9 W$ R# `5 V其次，PCR长片段Tap酶的选择，应该注意。既要考虑到长片段的扩增能力，也要照顾你提到的保真性的问题。8 K* j& S& n5 ?: u7 w5 Z
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还有，你是觉得这个方案能够减少序列中碱基突变的可能吗？但像这样的话每个片段也是经过了两次PCR，而且在最后一次4.8Kb的扩增中突变几率也该相对变大，除了在材料如保真酶等的选择上下点功夫，这个方案本身肿么会减少突变的几率？
1 u4 L, n1 v; M- y6 {) X. s
4 G. k0 y6 {% s- w* W. t; M7 j期待交流

ying

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( h8 r! w1 T- ~( w
( O. X: {; @- I0 b) d) t& |2 m# ~# c) D3 p" i1 u

% P/ i: Y  a8 L7 \我指的搭桥是overlap PCR。+ I# l3 ]% |8 l! ~0 p4 c
我也觉得理论上没有问题的说～
0 O7 K! o! W# O关键看“实践上”怎么样咧～1 ?. ?; H; }. F4 r# ?; q1 q1 L& g4 x
我觉得似乎应该在“四段连”的时候把两端的两个片段少加点，中间的片段多加点，连接的时候都浓度高点，4度过夜，然后最后PCR的时候template少加点。觉得这样会不会容易些～
3 V9 p1 Y2 D8 O; f" b/ n8 L9 ]
7 n6 d: |3 S  ^. }- m) C1 s多谢指导 ：）

zxcv12345

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1 R. W: ?- b( q3 {! E( p, Q+ h' j1 t4 o4 o- ~8 q# M2 s. B+ L
做的太复杂了。" V* G$ b  q( S
9 Q5 e+ N7 T) G; _
可以两次PCR搞定的
# i4 D' z6 {0 y6 ~2 {设计引物时，要在A\B，B\C和C\D之间有重合，然后分别PCR，回收各自片段。+ L, w" i& h2 ^3 }) u; j
然后模板用A\B\C\D等量，引物为A 5末端和D 3末端，直接PCR。! b! A" `" ~( E. H0 b) l
, R9 y) U  O3 C$ h  n3 t
如果A\B\C\D为不同基因的片段，可考虑一步PCR搞定。用所有重合的引物，及模板PCR。

LQAI2012

+ R0 |/ d3 k- \( k6 ]
说不上指导啦……
: u. A# t! J, O9 W! y5 v  H! {6 h9 R! P& b3 p" a) C/ m9 I$ A
老实说，虽然这个方案理论上木有问题，也作为主行方案之一。但由于当时用的Taq酶没有扩增出我的“三片段”，所以实验结果并不是按照这个方案做出来的。而是最直接的，先连接三片段，再加入载体连接，然后转化，居然得到了重组子……之后换了Taq后，也扩增出了“三片段”，但那时已经到重组子筛选了，就没有顺着这个方案再继续做了。& ^  D* ^* G8 T
当然，你要连接四个片段，难度肯定大多了。但依然建议在你在做这个方案的同时，可以将那个最直接的最笨的“连接、连接、转化”的方案同时进行，当然，成功的几率很小，要是仔细算还有点浪费材料。但那个方案是比较省时间的，要是能运气好直接就做出来，就不用一步一步PCR纯化、酶切、纯化、连接……& e: ^; }$ t2 `7 j) P: l; B1 c
还有，要是直接将4个片段连接，不容易得到“四片段”的话，可以试着先得到“两片段”或“三片段”2 _, t8 n. U* B6 s. F- ?4 q  M

6 L3 n* F* M) }* `* x" i祝实验早日成功~！