胚胎干细胞转染外源基因，用什么系统比较好？

christophe

回复 wwy551 的帖子0 w1 B4 v9 s, n. o

9 h  p; l% L+ D8 VPCDH有好几个版本，你是用的哪一个promotor的载体？你的pLL3.7是带puro筛选的还是EGFP报告基因的？

wwy551

回复 bigsnow55 的帖子: I0 t5 N3 L5 L* z( f# K

+ K6 c5 B7 ?" [转染的目的基因连到慢病毒载体上，我们实验室用的慢病毒载体有pLL3.7和pCDH，这个关系不大。293T包毒，磷酸钙沉淀的方法共转染带目的基因的慢病毒载体以及另外三个包装质粒VSVG，MDLG，REV/RSV。

bigsnow55

' Z- l( G3 a+ ?& E$ `( ?- U0 i, h

$ k; W. @% C6 o一般的电转仪都可以吧，参数如何设置呢？

bigsnow55

回复 wwy551 的帖子5 N+ y* B( d/ X2 K
) a: Q$ V) y( P
请问你们用的慢病毒骨架是哪种，整个系统能否介绍一下？
0 _4 s0 v7 Q. ~0 d多谢！！！

kalaka

慢病毒合适的质粒有哪些？什么样的启动子比较好？

sdjjfangfang

回复 bigsnow55 的帖子
; O' p2 {: e+ x% k$ H, S
7 s0 C4 T8 O% a9 b8 }( k用什么系统要根据你的实验需要来判断，而且不同的转染系统对于质粒的要求也是不一样的。如果要求长期保持基因的表达水平，最好还是选用慢病毒，如果不要求长期表达，可以使用质粒转染（结合电转），或者是普通的转染，但是效率会特别低。

chinesezhang

回复 cochongg 的帖子% v- r. j- h3 h

. ~7 u3 F$ c. Z) a! r% v' v您那有没有电穿孔转染hES细胞的protocol？如果有的话能不能给我发一份，邮箱zhangxj@ioz.ac.cn，多谢！

wwy551

回复 bigsnow55 的帖子
: X: T6 f' W# F8 l, i% ]8 G/ d8 P; x2 `0 `4 x* [
建议使用慢病毒体系转染。目的基因可以整合进宿主细胞基因组，能长期稳定表达。我们实验室之前通过慢病毒体系向hESC转染HOXB4+EGFP，一年半之后重新FACS分选带有HOXB4的hESC时，表达强GFP的细胞比例还能达到85%

cochongg

电穿孔最方便吧

Yedan

Retro的会沉默的。Lenti是主流，当然还有电穿孔，但是得有条件