【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

& @0 _# P8 m& F% p3 [+ f) ~+ E$ D& O
主要有几个问题亟待解决
& K# ~$ q5 e5 [6 |1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？
3 j& M, d( A2 z; @, b9 T2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：" W, d: @% i; L2 c4 N8 V
  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？
; ?4 V* C9 c# b0 d% v, p  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？2 e& P  H  w1 V8 u; D( _7 _
  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？* k$ Q$ @0 `% R6 T5 [  q& X4 w
  D.这一步还有什么要注意的吗？2 _; R, }# h- C* j3 N) `
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
" T$ T3 x" q$ y: q6 L  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？. N# V3 I( F' Z$ E+ c
  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？
* n: w1 i% X, ^2 y- D9 L" Z- `4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
9 N0 T5 I6 }& Y9 b) v  A.在第几天开始诱导？
/ N3 G. ?5 ]! [/ @( L  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？0 _/ D" h. a, ]$ L
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？
9 ~) ~, r# I" ~' z  D.诱导多长时间可以收获？/ m" W, F4 ?# S) G' U& E
P.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？5 s) i' L, T/ E

& M4 b# P* F; o  o  s$ u& y9 L6 [非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。: O, d# n, c& B* _0 Q  |$ M
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：- [/ `' b! j5 X$ y7 x. D# x4 q5 @
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。0 m( I5 A; j2 L" Z. ~6 i( N
B.贴壁时间是2.5h6 U6 M4 d+ k% ^8 s! O& X7 ^5 |' W
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
3 L. }/ C8 X+ R, E7 G3 E3 t$ k& B# T: X, \0 \0 i
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
; u+ v/ n$ |! y+ F- e A.换液间隔一到两天，半量换液
( X* K2 F" O% gB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
3 H: D4 W: ?. O4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
" J7 E! N3 K/ W4 X A.在第五天开始诱导, ?8 |1 U: B, }, |; y4 W; O- I( p3 w
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
9 E4 S1 e5 h4 N  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
+ h( N! j" X, Q( k6 e0 G+ j( P9 P  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。, H+ U9 N  ^+ x# ^) x
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
- r( ?/ O5 F& ?# _9 g A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。  o! e# A7 ?3 u, _4 l9 z
B.贴壁时间是2.5h
; o' s9 U9 P. H1 y6 n' ]1 s C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
4 D' s6 s& T. Q3 h& Y! h  b% G; B; Z9 ^3 X3 O" H5 B
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
8 X+ ?2 Y/ w4 [! z A.换液间隔一到两天，半量换液
/ w8 F( Z* Q4 ?) H- x( S: UB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
8 ~& K  x% O- l6 o' ?* E" K" Y( N4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： 3 |! `' T( I' |" n
A.在第五天开始诱导3 t: b" E& h1 v! R/ R$ N
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。7 l3 K) j2 O6 p2 C; o& C
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
: {. b# b9 Z' ^# r6 W  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 9 ^$ \  C# x) h* `- v; S6 N
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

4 S% u- e5 {  i* n5 G感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

回复 大少爷 的帖子! I0 q6 ^4 U; t3 f% z  P8 P3 {) d0 v1 U- I
3 ?5 N! ~+ M2 \" \
请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
( U1 ^+ ?( n, P; M$ x1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

2 ~8 B% S* j' z* K第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

回复 大少爷 的帖子2 z; ^: }# ^8 j/ |% x
- V' w5 W8 ]9 E9 \  O# t3 \
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。