【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

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* R7 [9 I* T; O  u* m( c
主要有几个问题亟待解决; \  _4 x9 u/ Z; \
1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？, \/ l5 R3 H9 [% ?6 y
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
1 K, U5 Z) c6 I5 `7 ?+ J  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？
* s0 J4 S0 z6 L( _; w, b7 E  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？
( ^/ \3 k* h9 t  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？
0 v" u& R/ x" b, l4 }7 r) F  D.这一步还有什么要注意的吗？  X; o5 s) ~6 b6 P6 h; ^
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
$ W) P, \/ n3 T4 |4 p  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？
: O$ G, l7 Q( X- L  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？+ J! K& ]- N4 _7 j! ]) _
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：( e8 S$ q1 U3 y. m
  A.在第几天开始诱导？
1 s/ K: _5 t9 w+ E0 \2 M$ c- E  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？
! B+ |$ E" @6 R9 A! Z  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？( @! v2 B; D! [: _( H! E
  D.诱导多长时间可以收获？" m/ t9 H7 T) r$ E
P.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？* y; Q  ^$ }) i+ r7 i8 Y/ t5 l
' \9 ^# E- g6 Q: g! H4 V
非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
! Y+ Q) L5 M  s' Y; e9 E% ]. M+ f2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：. Q$ C# \* w) H3 v
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
& \; \9 V, M: Y3 G' d B.贴壁时间是2.5h
6 y0 ]* g6 c( i% H$ A5 F# K C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
* _! f3 h0 B" \+ g/ N, L- Z* e/ E- ?* v2 L! l9 o% c  v
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：; H! ^7 x2 q* L
A.换液间隔一到两天，半量换液
2 c3 [( ^1 f% LB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4  u  P9 B/ D2 Z- W/ v) h
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
2 N4 M3 J3 p/ P A.在第五天开始诱导& L$ |% C  i& F0 q  N* @
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
; p% U: Q2 `( i) N1 f6 X  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。; h0 B! L0 X+ d. U( y, d) M
  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
% `; M% t) K9 z4 L, D0 r2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
; Y7 Y. z7 @! y7 _1 m0 i' ~4 d' l A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
( v! P2 o' h) @3 G: q B.贴壁时间是2.5h" H2 T( o5 |3 u3 D; q+ O
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。5 l" t$ O, g/ D6 r( l9 B

: v: V2 d! ?* G5 ^/ q6 c3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
, N1 n$ ^/ l* J A.换液间隔一到两天，半量换液+ ]: K2 F' m; ^
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
5 j8 o. }" d# r0 u4 g4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
) e  J3 X7 U; h. C# [ A.在第五天开始诱导) i& s" o# ?' Q; v
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
7 s6 {; D& _; K0 M0 s0 Q2 k8 g  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。4 \; _, c  F9 q/ r8 |
  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 7 I( g) g  k5 M7 _+ j
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

+ u! B/ R2 s/ h+ ^
感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

回复 大少爷 的帖子7 {! f" Q+ q2 d* B
0 G: ^, V  A  ]4 ?5 g% ]
请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
4 N: m9 \6 f1 I3 L1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

* t) v1 _( n2 P第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

回复 大少爷 的帖子
  `) ?' \" L! w& G1 L6 q( j+ k3 ~; S( }4 K8 v( r" V. f
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。