【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

- w  \! O  [& I8 ~+ W9 P
% u4 L+ r4 u( s  I
主要有几个问题亟待解决
/ e  G6 A* X3 [6 e1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？
# c; A4 R; W  ~1 Q2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
. o/ u6 C9 R/ B1 S3 E4 A  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？
6 C' Q" l% {$ _" Z6 \! `1 Z9 e  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？
: `2 o" U+ s$ Q( C  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？
3 w7 l7 D& l& C# U  D.这一步还有什么要注意的吗？
* _- ^; {1 D1 d# E' N3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：  P; P: X' W1 Y7 I
  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？
$ q. [  m( F4 w  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？. ~# m. `* u& l: L
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
& C+ d3 E9 ~5 C; r" {' l  A.在第几天开始诱导？, ^) a$ ^/ Q  p6 j
  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？% @, n$ \" N6 i- C; ^
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？* l6 @3 @9 G: {! f4 _+ o
  D.诱导多长时间可以收获？
) P; [8 `3 d3 U6 ?P.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？% B) H% ~- x6 t
9 K2 r7 N7 K; S* q
非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。, J7 x. o- W: t% I+ m" w
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
0 R/ J& ?# s6 y& t, B A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。( Y# F3 z7 i$ W4 X
B.贴壁时间是2.5h
7 ~2 t1 e# H; q) p! M* Z C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
% Y* g1 f* x& a" l  i1 v+ A8 j9 P8 ]4 r5 G2 @. w7 \0 W/ y& R
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：) d. r5 @$ d+ ?
A.换液间隔一到两天，半量换液
  a  ?* o; B% I* EB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4; o, _# r4 B' ?% ?6 _: _4 V
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： % L6 j# u7 H4 c9 w( O, o. x
A.在第五天开始诱导' ?8 r  \% A  x1 K+ v' f
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。( U  |8 s' q- E* k5 x
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
& z$ H9 o# q# ]( I: s( {/ q( I  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。' v) K) A( S0 R) S8 r4 @
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：( |& c6 e& z' |% v2 W7 h8 ?% H( L
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。; o. w  s/ w' e* y/ l
B.贴壁时间是2.5h7 ~2 r% R3 \% k
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。7 e5 O! ?* ~1 d6 O4 x# d) b
& y; i, g9 k6 L$ C7 }+ H
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：- L7 D2 Z5 [& d  T' N; G
A.换液间隔一到两天，半量换液
+ U/ S, i( S/ K. u2 ]8 `7 YB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
  ~! N. ~+ G& @1 Z' h1 M4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
! H7 q. t. e& L A.在第五天开始诱导
7 u' D+ y: w' J B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
: @" O, j; j7 U# V1 D  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
! V# ]0 t  c! S: u  ?  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 ; m& P( F3 ?- x. I# ^# j7 M# p% B' D
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

' g2 S! s' z5 `- l; m0 v* w" s
感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

回复 大少爷 的帖子3 P% z4 s3 Y% `7 n% e
% Z. q" {+ x* S8 C6 R
请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
( h# j! O5 M% C' @1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

: j) o5 O& }1 O% J' b3 U+ P, F
第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

回复 大少爷 的帖子( r* i! D9 ~* {0 c; d" k8 e/ M# \  k
' C: v5 o+ E% \* J0 E
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。