【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

5 V0 x( P; ~  M7 @# \' e
3 Z) G# R. K. W
主要有几个问题亟待解决1 ?& v& O6 O1 E" I" l  O4 h* v
1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？/ f% P$ N- z1 N% ~. G5 M: m7 f
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
( r0 X8 _5 r- @8 o: K9 a  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？
6 \2 G/ r# F2 Z/ Z6 ]  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？& j3 K: ]0 E+ G+ J7 H, o4 x( l
  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？3 h+ C/ y2 S! {
  D.这一步还有什么要注意的吗？, O  P; o% y3 [/ |' P: i; ^) `
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
3 l0 h, r) F5 q  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？
# c; p; ?; a6 N3 R+ N  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？  @, \- m; s. k% N7 }7 o% }% ^) S( j
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：9 S0 o  C9 y* l6 }
  A.在第几天开始诱导？
5 S5 K% D* O* c9 S, d* @  U  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？+ X, o0 t, d7 w  s2 {5 o
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？
2 v0 D8 p) J, o2 N6 y+ [  D.诱导多长时间可以收获？% Z8 P6 j) t& U/ j  C
P.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？
5 Q- m+ ?. I0 G, G  L8 Q7 O0 A1 Z  T8 ~; L3 P2 D# T7 ]: P# O# Q! x, |8 t/ o
非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
- }3 r. f) c/ X0 X& e7 I2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：! G* o6 L' b' k; \8 \* x
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
# K+ Q7 S3 G+ v" s, N( Q$ s; N B.贴壁时间是2.5h  H) Y1 k% L8 m. u
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。0 a8 r) o# w  O
6 _9 B0 L( w4 n( o- z& m; U
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
- K4 b; a4 F: Q4 C+ H A.换液间隔一到两天，半量换液
( S$ v) S  V- R' M" RB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
6 W/ c9 e$ C! Y% l4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： + H8 T% B$ u( R0 Q! D) Z
A.在第五天开始诱导
/ X6 U$ B4 @* L B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
8 E5 ?. u- j* G3 ^  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。( [3 O! r, Y* P  U% ~
  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
4 n9 I; \) Y! C' U# P* O1 F2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
! o. m+ Y5 D, T! W: g( i& H: D% N A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。- c) j& F& j. T5 [. g
B.贴壁时间是2.5h1 ~+ v2 T: }! A% f
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
1 d4 x$ l; ]( M" S) |7 V4 X, u3 A, K) I) |- N4 X
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
: m& z( O+ }( s A.换液间隔一到两天，半量换液
$ ^" A6 v8 V: y- z+ q' S+ LB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
3 K! {1 l' B7 `! F  x4 F4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
# ?6 {. {4 S+ a- o/ ^ A.在第五天开始诱导0 N1 W% m" `$ Q/ p8 b' z4 a" x
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。( m, j/ O, N8 X+ y4 g& I4 j/ v
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。3 p% i/ d( t# o0 W) w6 Q
  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 , v& e! E0 }% N+ g/ H" R
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

3 y. B# ]; X/ T% F感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

回复 大少爷 的帖子3 r. c  @: h$ O. z4 r* G

6 x4 M6 o( D$ l5 u请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 " R2 s- M. L/ E
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

/ e& ]) v2 w8 T# @* e" e
第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

回复 大少爷 的帖子, g" O& |% |$ O* f1 [7 a' k+ u
' m: e" e5 W/ c3 U; U
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。