求分析内皮祖细胞分离培养失败的原因

violet_sc

各位大侠，下面是我分离培养EPC的详细步骤，分离后的前三天可见细胞增殖，后来细胞就不长了啊，甚至出现类似神经细胞的形态，请各位帮忙分析！
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1.颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒10 min，剪双侧股骨和胫骨，去皮，入超净台尽量剔除附着的肌肉和脂肪组织，暴露骨髓腔。
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2.用消毒针头在两端各穿一小孔或无菌剪剪去箭端，注射器抽取PBS冲洗股骨干、干箭端及胫骨骨髓腔至清澈，40um滤网过滤；$ w0 p: L5 |4 O1 d5 J
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3.骨髓滤液转入离心管 1000rpmX5min离心，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞， PBS 3ml重悬细胞，按 1:1比例，用滴管沿管壁缓慢叠加于Histopaque 1083分层液面上，注意保持清楚的界面，2000rpmX30min离心。
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6 ~) w9 \3 K" z, Z) s, x  J+ w3 j4.离心后管内分为三层，上层为PBS，下层主要为骨髓间质细胞、红细胞等。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS液，1500rpmX10 min，洗涤细胞两次。
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5.末次离心后，弃上清，加入EGN-2培养基重悬细胞。以2X10^6/cm2密度将细胞接种于已用200 μg/L纤维连接蛋白包被的培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养。8 d! M4 |, S& o) D
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6.细胞培养24h(早期贴壁)后收集未贴壁细胞，1000rpmx8min离心后以EGM-2培养基重悬培养。
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zz091115

前三天的那是早期EPC 通常不会活过7天 小鼠骨髓不是一个好的来源 个人经验

violet_sc

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: i" D7 f$ ^) b0 f9 Y& N8 b9 ^; K9 q
, b4 F6 F4 ]' e$ E( K- w我也觉得有可能是early EPC,可是按照这个步骤的说法能长的不错啊，应该能分出late EPC,我的怎么不行呢，你是怎么分离提取的啊，能告诉我吗，我比较下我的哪些地方不对？小鼠数量会少些吧

穿越地平线

你的PROTOCOL有点复杂，不需要这么多项目，如滤网，取24h未贴壁细胞重悬等，我做就不需要。养的蛮好的。

violet_sc

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4 ?5 W1 |1 o- b. c+ D7 q! L 你好，能发一份你的protocol给我吗  我的邮箱是liyaqian10@gmail.com   那你是怎么分的early和late呢？

violet_sc

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你好  非常感谢指导   你现在在分EPC吗  可以和你讨论吗