脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？

mengnancy

脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起，分离液对细胞有损伤吗？

大少爷

你说“用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起”，现在的问题是你分离的是不是淋巴细胞。' `& L; b+ f2 F0 z' F; l2 i
我们的分离方法：# v, O3 W# ?+ p* I, u
将25 ml稀释的血标本(全血去血浆后与盐水1：2混合)缓慢加入盛有室温的15 ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中。离心(参数相当重要)，慢升慢降。离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米(mm)处。将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。
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诱导CIK，细胞增殖缓慢，培养基的类型，添加的因子量很关键。不知你是怎么做的？
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我们做脐血诱导的CIK细胞增值效果是非常强的，比成人外周血效果好得多。

mengnancy

感谢大少爷的回复。& b% t$ @3 M# }5 q3 \
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！  o0 ^7 ^$ D7 N2 X6 Z

mengnancy

感谢大少爷的回复。
2 G  o. @2 t* M我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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mengnancy

感谢大少爷的回复。/ v: A  y4 v& g; t% a. }8 z4 Y
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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细胞海洋

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6 l" `* ~  o& z% x; B$ _感谢大少爷的回复。' A: r0 Q) T' Z8 B7 K/ D8 J
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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. C: \2 o) L% ^0 z: x  o大少爷 看前面

细胞海洋

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; W( l" W/ q2 y$ I5 I# E4 F3 @
. A6 B9 k0 |% l- L; T% k* X你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容 像我这样
, j5 ?( y9 g3 m3 Y; C; i/ a否则 他会可能不到你的提问

大少爷

不知你的FICOLL是什么牌子，你可以按照说明书上的离心力和时间来离心。吸的单个核细胞层再加PBS洗涤两次，去掉一些红细胞和血小板等杂质，离心力300g左右。5 ?5 J) S  Y% V! G
用Ficoll液分离PBMC，洗涤两次，计数并用培养液调细胞浓度为 2x106/mL，当天加入1000 U/mL的IFN一γ于37℃，5% CO2悬浮培养，24 h后加入50 ng/mL的CD3McAb、100 U/mL的IL一1及1000 U/mL的IL-2，，每隔2~3d换液一次，前期细胞状态不好可以半量换液，状态好的话等量加液。第三次加液前先计数，然后按照1-2x106/mL加培养基。; `; k# U" z5 d" P- H
CIK一周左右时增值的是最快的。第三天或四天的时候数量会有所下降，第七天左右会急速增加。所以不要着急，先养着看看。3 L# X% w& T5 p

/ d9 q2 I) E/ j/ L5 J前几天换液，如皋状态不好，是吸取一半培养基，离心，换新培养基重悬细胞，按照总培养基量加因子。

hwlightning

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  M% |# w0 H4 g# k+ b5 k( i5 C& w2 [8 ]" ]: ], @; g) N& A+ w
请问下，你们用脐带血诱导cik，对血液除了传染病学检查还需要做哪些？

mengnancy

回复 hwlightning 的帖子  Z. Q/ c* I0 J8 l8 b* w: v

0 |) y( N  F& [* Y1 k对脐带血只做了传染病学检查，包括乙肝表面抗原、丙肝抗原、梅毒和HIV。因为现在做的是预实验，所以其他的没有做了。