求助各位大神，我想做有关神经球的双标免疫荧光

changbo529

' ]0 Q' c! v2 @; w) Z. f1 E

2 q8 U( b% G( i" G1 a! ~各位大神，我想做有关神经球的双标免疫荧光，不知道都应该注意哪些问题，求指导，谢谢

dianying

回复 changbo529 的帖子
. [  {+ s" L8 B3 K6 s3 a
2 i) e5 t5 e7 s6 w染色不难，只是照相要用激光共聚焦照Z扫描才能把不同层面都照着。

changbo529

回复 dianying 的帖子
/ r, t& H) i) u. `0 X0 x9 }6 a, x, f* ^8 r
我们这实验室有共聚焦。只是现在是个菜鸟，想了解下双标的染色步骤及注意事项，比如两种抗体加入的时间，及种属的选择方面。谢谢

dianying

回复 changbo529 的帖子; w+ b) Q0 a/ s2 a4 U

2 W' e5 |; F) t! u2 T种属的选择还需要看你用的细胞是从哪里来的--人还是动物？什么动物？一般你买的抗体都会有说明。1 Z/ V$ }" ]' F( e
抗体加入的时间没什么特别，双标用不同的种属同时加入就可以。加二抗以后的各步都要避光。

changbo529

回复 dianying 的帖子
" t, J, D( C7 s* t
9 X3 h. ?6 m8 \% d) Q7 o抱歉啊，我还是不太明白。我的细胞是来自大鼠的。如果我选的一抗分别是兔抗大鼠和小鼠抗大鼠，那么我选的二抗是不是必须为不同种属的动物分别抗兔和抗小鼠，如山羊抗兔和驴抗小鼠，另外在这种情况下，我应该选择哪一种种属来源的血清封闭呢？。还是可以选择同一个种属的动物分别抗兔和抗小鼠，如山羊抗兔和山羊抗小鼠，望指导，或者给我一个关于大鼠细胞的一二抗种属选择的Protocol.谢谢啊

dianying

回复 changbo529 的帖子7 V8 B. b/ p  W6 u

, b, k5 f  x1 ~$ U$ sExample:
+ M, b% U  X& ~, c; `5 d! a; K8 |  ]* C( J! ^" d- ^+ e- G
1Ab: Polyclonal rabbit anti- Rat; 9 a* c- b* j! o; u. {$ ~
2Ab: Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit or Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit% V* _' D9 a& Y% k
3 _+ y3 h: Q4 |, \7 |
1Ab: Polyclonal mouse anti-Rat;
2 m! J7 e- @+ t3 f% y/ T2Ab: Alexa Fluor 488 goat anti mouse or Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit
5 Y8 i5 a9 O8 t" n. p' f- W# o! V/ X! `$ a- S5 ^6 p
; p/ H4 g# e3 a) a

dianying

回复 changbo529 的帖子
9 K3 n0 p8 X! H' G
6 e7 J- x# r- J2 |6 a; ~. @2 N, O% O& z我没做过大鼠，Protocol在网上也不应该难找吧。指导更谈不上，在染色上也是菜鸟水平。9 Y* W& z; C# |' ^" R7 x# ]
封闭通常用BSA 或者NGS。
9 R; f+ E5 x6 z: T8 A2 \' T! Z' G6 M! ^+ \: x6 e( C

changbo529

回复 dianying 的帖子
' T% [$ u: }& u2 ^
( B; V! M" K4 g! z! a7 S也许是水平有限吧，我在网上没有找到太多关于双标的Protocol。谢谢你

dianying

回复 changbo529 的帖子
' a$ V: {- C9 s7 M+ u. ^8 W5 V! k9 ]8 D: h% A% C8 O
帮你找了个大鼠组织的单标中文视频，你需要双标就把两种不同属种的一抗加在一起就行，二抗加相应的就行。我只做过人和小鼠的，应该通用。% q3 Y) o3 d& L7 F- s
或许等我有时间再帮你找找。
9 d9 f8 W3 O7 }! g% [
) c9 q7 L  i, U6 l" B9 k; b! ~http://v.youku.com/v_show/id_XMTY1MTI4OTY4.html

changbo529

回复 dianying 的帖子- M" i) j: f: U- j
0 `4 A7 n$ q2 ~- F
谢谢。我做过单标的，实验下一阶段要做双标，所以先提前做准备。仍然很感谢你。