求助各位大神，我想做有关神经球的双标免疫荧光

changbo529

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% p1 {/ L" K3 B- U5 }" D% h
各位大神，我想做有关神经球的双标免疫荧光，不知道都应该注意哪些问题，求指导，谢谢

dianying

回复 changbo529 的帖子0 t" x1 j: q' T) F: d$ U/ F
9 D- L. N0 L, O% e1 {
染色不难，只是照相要用激光共聚焦照Z扫描才能把不同层面都照着。

changbo529

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  ~, t& [' n2 P6 x! r+ W  @$ \. _- t% ]( O9 r& B  i
我们这实验室有共聚焦。只是现在是个菜鸟，想了解下双标的染色步骤及注意事项，比如两种抗体加入的时间，及种属的选择方面。谢谢

dianying

回复 changbo529 的帖子2 r4 H( l" N" w( U0 W% }8 N4 f; C" v

6 N" i0 m! Y- i! ]8 d8 R& K1 s种属的选择还需要看你用的细胞是从哪里来的--人还是动物？什么动物？一般你买的抗体都会有说明。
/ c3 N& l  e1 k/ V( I2 Z6 G抗体加入的时间没什么特别，双标用不同的种属同时加入就可以。加二抗以后的各步都要避光。

changbo529

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* m3 [% p& O+ _/ P9 P% a+ F- y* {2 f' r+ s8 i9 h2 G7 w1 ~
抱歉啊，我还是不太明白。我的细胞是来自大鼠的。如果我选的一抗分别是兔抗大鼠和小鼠抗大鼠，那么我选的二抗是不是必须为不同种属的动物分别抗兔和抗小鼠，如山羊抗兔和驴抗小鼠，另外在这种情况下，我应该选择哪一种种属来源的血清封闭呢？。还是可以选择同一个种属的动物分别抗兔和抗小鼠，如山羊抗兔和山羊抗小鼠，望指导，或者给我一个关于大鼠细胞的一二抗种属选择的Protocol.谢谢啊

dianying

回复 changbo529 的帖子/ D; r" D) Y; s
& T5 d- c1 t8 `1 C& E
Example:
; X9 M7 Y9 h3 F
* P3 e; l' x% w# u" C5 P! C4 j1Ab: Polyclonal rabbit anti- Rat;
7 A% K! v4 z& t* K5 l2Ab: Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit or Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit
: g; q1 t/ s+ v
- v# I! {( ]  p. A1Ab: Polyclonal mouse anti-Rat;
, @( Y* l0 t" G8 ~# x3 w2Ab: Alexa Fluor 488 goat anti mouse or Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit% Z/ c- A# u& N) R6 F) u/ v/ R6 Z
) w( v0 _3 B8 K3 Q1 d

8 A3 ]3 V7 o7 T3 a+ _

dianying

回复 changbo529 的帖子3 l, z& }- o* ^- `8 \

  ~" u1 Q, ^; K; _7 U我没做过大鼠，Protocol在网上也不应该难找吧。指导更谈不上，在染色上也是菜鸟水平。
8 Y0 e2 }3 F! o& L) s' L封闭通常用BSA 或者NGS。
8 B0 _: M6 @: z+ w1 X, X/ i
  L* b8 z* ^6 I  t2 |

changbo529

回复 dianying 的帖子) L" C2 W  W( O. y3 T; u

  t- l% j6 @; q0 ]# z- `也许是水平有限吧，我在网上没有找到太多关于双标的Protocol。谢谢你

dianying

回复 changbo529 的帖子3 ?. g- y: F  [. u  D& {* L( H
% R" d' b9 f& g1 d" y1 n
帮你找了个大鼠组织的单标中文视频，你需要双标就把两种不同属种的一抗加在一起就行，二抗加相应的就行。我只做过人和小鼠的，应该通用。4 f+ x0 _7 z7 R& z2 u+ Q5 O- N, ?
或许等我有时间再帮你找找。( N* B: O  s1 k5 N

2 i7 U8 c+ o. n! M' fhttp://v.youku.com/v_show/id_XMTY1MTI4OTY4.html

changbo529

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- ~5 z( v& g$ S, H7 p8 Y$ `  w4 J# j9 C) E) H
谢谢。我做过单标的，实验下一阶段要做双标，所以先提前做准备。仍然很感谢你。