请教高手：怎么才能做出好的ＥＢ呢？

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我以前做过EB分化造血细胞，不过是hESC做的。因为当时做的EB状态都很不错，所以说说给你参考一下吧~~) y0 \% L  v+ t6 i0 _- R9 v
dispase消化ES比正常传代消化的时间久一点，等ES克隆自己脱落之后，收集至离心管中，不离心，静置离心管让里面是克隆自然沉降，然后吸去上面没沉降下去的MEF feeder。DF12洗一次沉降的克隆，依然让克隆自然沉降，吸去上层的DF12。这样做可以保证得到的都是状态很好的克隆。最后用ES的培养液重悬接种至低贴附培养板。第二天开始用分化培养液分化。一般刚开始的两天，EB在显微镜下看起来发黑，随后就会慢慢变得圆溜溜，亮晶晶~~

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1 q. K' ^$ o" D. B! ?4 x. E( c( K/ W% _: h( \
当然了，做EB对ES或者iPS的要求也挺高的，ES或者iPS状态要好做出来的EB才会好。
+ O* I  [, Z0 ~1 c7 g4 U另外，我用静置沉淀ES克隆的方法去MEF的效果很好啊~~

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, n% E6 i7 i) M
; Z2 @1 U3 ^; ]) g7 `! @+ |- @MEF当然也沉降，不过远没有ES克隆沉降的快啊，等到大部分克隆都沉下去了，吸去上面没来得及沉下去的MEF，而且这之后还会用DF12洗一次，这样也能保证很大程度去MEF。
4 K2 y9 J) V$ g( @2 L* w, |沉降这个不需要很在意要多长时间，看着大部分克隆都沉降了就可以了。我以前做的时候就直接把消化下来的克隆和MEF一起收集进离心管，就那么放着，然后做别的实验~~

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6 c- T! i- j( T/ z2 C  Z% J, w6 @/ O2 L
把ES克隆用HESM重悬后接种至低贴附板上，第二天就可以开始用分化培养液分化。
& W& e- v5 ~' o! [5 Z并不需要等到EB完全形成，在分化的过程中，EB会慢慢成形的。
5 a$ [2 C+ P9 B2 N: e所谓低贴附板，就是防止细胞贴壁生长的，不同于常规用的细胞培养板，比如做造血分化分选出来的CD34+造血前体细胞就可以放在低贴附板上继续培养，这样可以抑制内皮等其他需要贴壁生长的细胞的生长，也就间接促进造血细胞发生。低贴附板有商品化的，买来直接用就好，不需要其他胞外基质处理。
4 b5 l2 W  P6 ]/ K; r另外，实验室用的普通培养板如果经polyhamin处理的话，也可以当低贴附板用。

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) b  d: p/ n# b, }# n/ _, H. _0 M* e) x5 B$ H
用collagenase代替dispase应该也可以的，我们实验室只是很普遍用dispase。: c% Q  a- r8 O) i: x
如果有分化的ES，看分化的严重程度了，如果很严重的话，建议还是刮掉，毕竟ES状态不够好，做出来的EB状态也难好。如果只是少量边缘分化的话，应该影响不大，经过之前降到的那种自然沉降处理，还是能够把中间的克隆跟边缘的分化细胞分开的。

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4 A* |* D5 s0 `你这种做法治标不治本，建议重点想办法调整ES状态。, k, W$ _( B3 d- J3 e
问题可能出在你用的MEF上。不知道你用的feeder是原代的MEF传到几代做的，建议不要超过三代，而且每次传代的时候比例不要太高。或者你可以适当提高你现在养ES的培养基的bFGF的浓度。总之，不管接下来要做什么，一点得先保证ES的状态很好，不然做下去的话也不会有像样的结果。祝好~~

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  c( t5 a) W8 i6 @- x0 u$ a, V3 l' Q
你这种做法治标不治本，建议重点想办法调整ES状态。
1 e/ Y2 R4 C2 F) L- [! N! x/ a问题可能出在你用的MEF上。不知道你用的feeder是原代的MEF传到几代做的，建议不要超过三代，而且每次传代的时候比例不要太高。或者你可以适当提高你现在养ES的培养基的bFGF的浓度。总之，不管接下来要做什么，一点得先保证ES的状态很好，不然做下去的话也不会有像样的结果。祝好~~

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4 O/ O& |9 a$ X% h# g你用的bFGF浓度正常，MEF有点过了，别传到5代再用，四代都勉强吧，最好用三代的，这样的MEF状态会比较好，分泌FGF的能力比较强

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回复 刘森泉 的帖子- G& F! a9 P( m" q5 L

2 ]0 g/ o3 x- H2 G) E( A9 G我们都是用1ml的移液管刮克隆，当然你消化克隆的时间也得足够，看到克隆边缘卷边的时候再刮。刮的时候，移液管垂直培养皿底面。枪头的话对细胞损伤太大，我们从不用来刮克隆。

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回复 刘森泉 的帖子: q8 K. B4 @+ b7 I* |% K7 T

  w3 ^8 M- J* P  e) W- J就常规传代ES的做法操作就可以啊，不知道你平时是怎么传代的