小鼠ES细胞胰酶消化传代问题

narajie

最近在样小鼠ES细胞，第一次6孔板消化的时候消化2min，feeder就在上清液了，去上清后，es细胞是粘在一起一整块的，后来听说ips胰酶消化应该是feeder一整块下来，细胞还贴在皿上，请问这是因为细胞类型不一样吗？但是我直接就这么吹散传代了，传完后也没什么问题...接着第二次传代发现feeder消化了5min+都没下来，10min都还没下来，但是加进液体吹下feeder连同es细胞一起下来了，请问各位有谁知道这是什么原因吗？平常大家养小鼠es用胰酶传代的时候是feeder消化下来还是es消化下来，消化时间大概多久？怎么处理的？....目前非常困惑，跪谢！！！(对了，第二次的时候细胞有出现过污染，但是我加了双抗后也没什么大问题又继续养了，这个应该没影响吧...)

zmm

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, ^% n- h% [/ ~- O1 ]. v4 s# V5 `小鼠ES消化传代时ES和FEEDER是一起消化下来的，消化时间大概在2min左右，37℃。你可以发现ES细胞变成比较分散，变成单个细胞之后，你就可以终止消化了，然后吹打收集，离心，接种就可以了。
8 w6 z* h. Y- T; ~, e; ?污染后的细胞最好还是不要了吧，以免有残留影响你接下来的实验，那就得不偿失了。

narajie

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3 `" L) W$ {6 j+ U$ k0 ^6 \. h% @' G! g9 f5 U; t$ L. S+ i/ a
可是我最后只能要提蛋白，不能要feeder，能有办法去掉feeder吗？

wawj

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  A. s. y! |' {/ K+ R
0 d& P: e: G. r3 G% q5 ]' [那你就差速贴壁，贴个一两次，每次20-30分钟，尽量去干净feeder

amberma

不同培养板情况可能不太一样。
) C5 C5 B1 S1 `7 R1 R/ N0 c我们是用的T25瓶，PBS洗后用胶原酶4在培养箱里消化15min左右，镜下观察。
9 T( ]) R, x: H) p8 N) ~用培养液把其余克隆轻吹下来，这样里面feeder量就不多了。; @# Q: C( |' k4 Q
再差速贴下壁，feeder基本就能除净啦~

narajie

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  X1 Q/ R7 D  i4 a: w
有贴的这么快吗？我也试过，我把消化下来的含feeder和es细胞的放在培养箱贴壁2-3个小时了都还不贴壁...这时候培养基用什么？MEF还是培养es细胞的培养基？

zmm

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提蛋白哦。简单，就用明教悬一下就可以了。37度10min

narajie

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: ?7 x5 F- q( A; J3 [. D5 h; k  P3 ]  n; u6 ]" ^' Y- r
你差速贴壁是怎么做的？用什么培养基？我也试过贴了2-3个小时还没贴上...

narajie

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6 V0 h  I: x3 q0 S$ v
( V2 D5 r  L% g明胶悬一下？不懂...没做过...能否讲得仔细点？

zmm

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就是把收集好的细胞放在提前铺有明胶的皿，放在37度，10min。feeder比较大，他就会先贴壁，而ES细胞还是悬浮的，你收集上清就可以啦，就都是ES细胞了。