怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

: N7 K; i% V! T) [+ L* C- k
- w( {4 b7 r/ Q8 b; J3 _
因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR) p3 j3 h) p; q; D0 h% k0 M
结果如下图" ^  l% n. w3 W4 S) t
B组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点
; J* }3 `3 R. F% h" |3 W- ~

2012-7-17 23:37 上传

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! L8 S& v8 i4 G& W这张图片能不能说明一些凋亡情况的？  m; M6 R) S, ^/ @2 N9 ~
或者需要做哪些基因才比较好？
% }( u! X( l& w8 r# c& S期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？
% J2 e0 m1 i/ \: {( Y" U我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
6 W1 B2 |' |+ o不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等
, o- |) v, c4 W0 h) ~' p

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子1 o5 l, y2 b/ K

$ I! }$ z! v8 j" x* c" ]一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子# D- b& j; l6 ^# W( v' \) u

7 e* y; f$ K. P, v  p+ X) H0 O( IFas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

+ ?& M; w! q1 s/ r( T# }

  N' i. m; z! ~" J3 _3 ^' g6 z检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：
/ }; _( l1 {5 C1 E! `% ^7 \1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。2 L; l5 H% D$ T- |& p# J
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。
$ x! a$ s7 q1 g" T; Y* N1 e1 O根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。; Q$ w! V0 }# t: B' Q
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。
) a, {; [" c8 U# c" Q- R. N2 h
% ~$ p. F7 t/ H
) ^1 d! o7 Z% H6 q5 y/ h
; `. B/ @0 J9 V9 n我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子& M( D7 I8 W- [& `. A
1 E7 ?5 S# G5 M( O
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
/ P; I! Z8 q+ T, i# Z' `我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下* O* m1 c4 Z: P5 G0 q
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA
! H$ P3 Z/ V  M$ T: lNCBI Reference Sequence: NM_007987.2
; i( s5 I* T4 R- w; w6 ]9 M$ G. _  \% v& f3 A9 d
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA
0 y' N( d- g2 |4 _  H' K0 iNCBI Reference Sequence: NM_207681.2# r+ G0 Y' |: K, I+ J. i# _
% f8 w9 T1 O4 a3 [2 t
Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA- X* O- p2 I3 N- h6 ^( H' }
NCBI Reference Sequence: NM_177410.2
0 v6 j: w7 l3 O  d* e6 s
) V( w* @1 ?* e" ~! ~* cBax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA1 P. ]4 O9 `* ~9 y5 _9 t
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3
& ~9 i/ P7 [- M: E
' m$ _- g. V# P$ L) r另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
# Y9 H, L* \! i所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？. R+ P; g, x' J' u* `' |- O

jiojoo

回复 希望之光 的帖子! L7 }" Y) M0 ]9 R# d+ B

7 U- y. ?4 ]) A' [+ C9 w感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。7 {) f* g5 P$ v
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下# \, M* U7 C7 Y* o
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
1 a% P; Y' O2 o: ^$ g2 H1 r% H2 e4 K1 i另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？5 o8 w$ U0 `" o0 K