怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

+ k% Y. D' s2 @2 P8 g. G" I: s! [

$ O) g% k. T+ f3 B因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR
6 Z1 c0 m  w' k$ f0 h% Y结果如下图
$ N7 R/ C( ^8 ~, k7 V3 F$ P7 UB组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点
4 K  L2 s6 Z; {: n: A, `

2012-7-17 23:37 上传

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这张图片能不能说明一些凋亡情况的？
3 Y7 |- _+ T9 ]" H5 }. ?2 \或者需要做哪些基因才比较好？' Y. l. T8 \2 s1 A8 c
期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？
. V5 \# e& o7 d4 m0 ]3 B7 `我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
  n1 ~, q1 K- ?' a* r不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等8 m4 t# g# ~; V% X' J

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子* I( D) t+ ]6 j- D+ g8 G9 b

7 ~$ o% D1 b% Q) a" \一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子0 R" P4 R: X' f( w4 i& M' J

& p$ e- Z4 n0 e4 y9 N; k) XFas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

0 i1 }+ }$ P( L, w
  C2 L6 Z$ g2 D( c) v; `检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：' A  k) m9 {( \
1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。  K0 F  n4 F0 K/ R9 b1 h3 ~* ]
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。$ B$ r2 L0 A" D3 Z% {0 S2 ?
根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。8 L$ u) P: N& ]" @" a
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。- x8 }0 I, l) X8 K- B3 M# c

4 D4 R; M1 b$ z7 v  O' a7 M
  M) e- u- i2 I. E8 W3 m# u2 C! @2 N1 t, R9 y# ~7 M: S
我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子) T/ w' b0 K6 e( C8 b: l- e
& e8 e# R3 d# ?, Q* H  y
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
. k  L. |+ H) o8 f; q我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
% h$ v# p0 f; q: q# MFas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA) Z3 p' ]- A4 `9 O3 _; u, a
NCBI Reference Sequence: NM_007987.2
- ?5 I6 f3 v! x, f, ]8 E# m1 ?! }) j$ F8 X! B4 e8 q2 s$ i! ?
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA0 |/ j; p% D; E, `
NCBI Reference Sequence: NM_207681.2
2 D& Q- Y; W6 ^) |
7 j4 o2 G( E6 l! k8 F7 |  |3 `Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA4 H1 e+ L9 H( O7 J" [5 D# Q
NCBI Reference Sequence: NM_177410.2" h* Z7 q3 Z2 A+ S  v

6 y6 s9 Y3 p. b" y! jBax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA  z: d/ M* v1 o: @
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3# R' w2 y9 O# G9 b. Y8 B, c' ^
" o7 _1 G8 _$ H" X6 U
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
0 g3 g2 F6 O+ y1 r7 D: ^7 r所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？
$ L& S7 m2 z+ D. ?* U- k( Z

jiojoo

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0 m" g+ ^# @" b' F
  ]2 K5 |" d$ Z6 y' a4 _感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。- S. s9 f: {& S  C
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
( P9 @! A& t6 }6 L4 b  j另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
& M% v! v$ V9 n; e5 e7 D. D另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？  e( N! L( g: H2 {5 n; i6 U