怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

# v# D, V; |# R% [/ y
/ F/ B* p. t4 r4 k4 Y( T+ v
因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR. f" I6 @1 }" q% B% X
结果如下图& R: J6 j# f2 Z& O
B组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点  G) z# @* s. V; b

2012-7-17 23:37 上传

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, r2 Q3 i: ]1 F+ M/ q* |+ N
这张图片能不能说明一些凋亡情况的？: @% V! r+ z& j1 S+ \
或者需要做哪些基因才比较好？
/ n2 _/ j; t* a/ n' l9 p, l- @; _0 }期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？
, {6 {' m% `8 E: J% R我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
1 X8 |  E; R  r5 g) n; r' Q不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等
+ U# p2 b, X* m2 w' Q% @% U

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

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: j9 \7 F9 S2 S' Y# P+ b# @5 q0 P5 V1 f; w& u; ?/ s' L& G
一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

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. ^( f7 l/ {( k. k# n
) K' [4 {; w( K0 P5 aFas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

( r# @! P( |8 A) `7 v* X
: e+ b7 ~+ O4 m$ V4 E% i检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：
% G, \6 @% N9 B8 ?1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。6 H' |3 y! D" ^1 S! E7 }0 m
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。
' H9 s+ F  s# H+ o( Z4 W4 r# C根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。: [7 R# u9 z7 d, v
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。" }/ S& U9 X- y1 {0 P+ k
7 _: y% _$ I) b( O

1 w) H- k0 c, \4 x1 T6 o! ~! @4 o% v' a3 `5 y
我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

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% X1 O' W4 Q; k' f9 Q0 Q+ J
! J; C; }  l8 |/ T2 ~" h% S6 l感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。, k2 B- ^0 l1 p
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下* P5 E( z4 |* g% `+ S' ]; r
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA% n4 q  [7 h: }' E# t* W
NCBI Reference Sequence: NM_007987.2
- V, Q) @9 v: G/ N# {. q; [) B6 h  t# u0 S% Q2 D6 e( Z" M, U/ t
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA/ J3 p. u- m, G* z
NCBI Reference Sequence: NM_207681.2; N/ s  f7 h  p9 k/ G
5 i  z, U6 W/ o
Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA; I. K  N# w% p. z  K! L
NCBI Reference Sequence: NM_177410.28 L! x  X0 d, z1 ~4 C2 W
8 a% S4 t) ^( m. F
Bax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA
& U: y; F: q. O/ F3 b, l- MNCBI Reference Sequence: NM_007527.33 d, B$ L% G2 Z3 q
! s2 q7 I3 s& c0 C0 A* m  n
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~, ^; f: ~# `9 a* n8 B. X, J. _$ s
所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？9 h2 {7 X4 V' {& Y/ b

jiojoo

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% M2 T# b: q  M. C" J6 r  d1 A/ G
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。$ B) o3 @4 Q0 b: C2 ?
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下- O3 H+ j4 r" \* {, {
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
, R- y& Q8 v6 I  |  ]1 `另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？& y7 Z: F7 g! q) p8 e5 h