怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

9 e' s- S) ]2 o  K6 X. C& P
9 R, {! X6 G* W+ G5 S4 B因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR
. d1 H. X3 W7 x& H结果如下图
. f4 h( w4 V& @1 PB组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点
8 l  P! s# a/ f

2012-7-17 23:37 上传

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- E8 {% F# p1 i这张图片能不能说明一些凋亡情况的？& z) i: Z' m. g" C
或者需要做哪些基因才比较好？3 @7 }0 l/ o) [& z4 I  L
期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？
) ^* B4 G, [, o$ K2 _我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
1 r$ _; L8 r. v$ A/ i不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等+ C3 o" h2 G$ m. d

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子6 z, b# P  j7 f$ J: v- c
# r2 R) u1 U4 h9 ?
一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子$ E9 V& R; }2 B0 n

1 Q" r. j9 J1 E% {  LFas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

9 o! S0 d" u% P; W
: w2 G1 ~5 U5 x' r4 C. N7 P9 P
检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：9 P$ q, \0 S3 q
1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。
: a# s4 u4 K. B! h2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。0 a! |( p, U  a" Z
根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。' n! `7 J+ \5 S& a; E/ h: c0 C
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。
* k/ N6 J% l! E: w6 n9 f' {3 o/ `/ |8 q( M
' }* j& m  S8 p- P6 `

7 Y2 ~# w0 ~8 f1 g3 t我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子) r2 o8 s$ q  O/ S* V
6 C! c, i( u8 P+ f% p
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
" C6 `/ `$ K0 L9 k# l" ]" N我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下8 i& _* V5 ]& g( t
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA+ I9 Y: ^* P2 U5 i
NCBI Reference Sequence: NM_007987.28 S( E0 Z7 l1 w" X
1 Q: b9 P  c8 D2 N
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA, t' H* I. s( z- Q6 c; P( b7 |
NCBI Reference Sequence: NM_207681.2
( i' N6 B2 m, Z4 V, v* S9 ?4 w# |0 v6 e' w. O5 n; J0 R* I
Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA
& W+ |# U" B- yNCBI Reference Sequence: NM_177410.2) V4 W& o# Q6 Q: Z
# F+ ], A; U" L  y  R; [; i9 g
Bax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA* J* w  o" E, a
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3
/ c' k/ E2 q, I+ P- k9 i
$ U1 J: m  C* H另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~4 {- O5 M: T: X. V* M4 v) O
所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？5 Z/ Z! E$ W/ ^5 U+ T3 a# u

jiojoo

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8 w3 @+ `# Y  ~4 [! k+ m; }, T/ d1 W2 _6 ^! m% ^
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
9 J+ r2 [8 f1 n0 G! Q我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
8 L9 |. W! r+ l8 q. F$ F另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
. ~- O1 U( e; w8 o. a' h另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？
9 [6 ?+ v7 ~7 P5 o$ N