干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

 

 

搜索
干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 干细胞之家论坛 干细胞实验室技术交流 实验室综合讨论区 怎么通过基因表达来检测细胞凋亡?Fas和Bcl2,bax,BclX ...
朗日生物

免疫细胞治疗专区

欢迎关注干细胞微信公众号

  
查看: 91107|回复: 17
go

[请教] 怎么通过基因表达来检测细胞凋亡?Fas和Bcl2,bax,BclX能不能检测? [复制链接]

Rank: 2

积分
229 
威望
229  
包包
871  

优秀会员

楼主
发表于 2012-7-17 23:39 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 jiojoo 于 2012-7-17 23:42 编辑 + k% Y. D' s2 @2 P8 g. G" I: s! [

$ O) g% k. T+ f3 B因为样品已经没有了,只是还有cDNA样品,想顺便检测下细胞的凋亡情况,所以就定了几条引物跑了个qPCR
6 Z1 c0 m  w' k$ f0 h% Y结果如下图
$ N7 R/ C( ^8 ~, k7 V3 F$ P7 UB组是对照,三个处理组,分别是D组、F组和H组,3d和5d两个时间点
4 K  L2 s6 Z; {: n: A, ` Apoptosis.jpg ! H+ H" I8 v$ w8 M$ u$ X7 U) J+ X2 \' J
这张图片能不能说明一些凋亡情况的?
3 Y7 |- _+ T9 ]" H5 }. ?2 \或者需要做哪些基因才比较好?' Y. l. T8 \2 s1 A8 c
期待大侠的意见,非常感谢!
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
1354 
威望
1354  
包包
484  

优秀版主 金话筒 优秀会员 帅哥研究员 小小研究员

沙发
发表于 2012-7-18 08:34 |只看该作者
Fas是受体吗? CD95R?
. V5 \# e& o7 d4 m0 ]3 B7 `我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子,可不可以检测caspase呢?
  n1 ~, q1 K- ?' a* r不知道你研究的是那一块儿,但要是想检测凋亡的话,通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等8 m4 t# g# ~; V% X' J
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 15 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 15   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
347 
威望
347  
包包
942  

优秀会员

藤椅
发表于 2012-7-18 08:45 |只看该作者
凋亡相关的基因有很多,首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关,单凭图中的数据来讲,并未发生凋亡,或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
481 
威望
481  
包包
479  

优秀会员 金话筒 帅哥研究员

板凳
发表于 2012-7-18 08:58 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
我们可以好好交流一下的,我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验,也是第一次做这方面的实验,昨天96孔的板刚刚给药,今天先大致检查一下细胞形态,做下荧光染色,看下凋亡小体等的情况,做个DNA电泳,看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸(ps)的含量,请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围,行不行。谢谢指导。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
481 
威望
481  
包包
479  

优秀会员 金话筒 帅哥研究员

报纸
发表于 2012-7-18 09:02 |只看该作者
回复 yuhaoze 的帖子* I( D) t+ ]6 j- D+ g8 G9 b

7 ~$ o% D1 b% Q) a" \一般检测caspase的时候,起始caspase和效应caspase都要检测吗?通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗?
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 1 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 1  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
481 
威望
481  
包包
479  

优秀会员 金话筒 帅哥研究员

地板
发表于 2012-7-18 09:05 |只看该作者
回复 yuhaoze 的帖子0 R" P4 R: X' f( w4 i& M' J

& p$ e- Z4 n0 e4 y9 N; k) XFas是外源途径中的受体,它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用,其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 1 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 1  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
1354 
威望
1354  
包包
484  

优秀版主 金话筒 优秀会员 帅哥研究员 小小研究员

7
发表于 2012-7-18 09:17 |只看该作者
本帖最后由 yuhaoze 于 2012-7-18 09:23 编辑
0 i1 }+ }$ P( L, w
  C2 L6 Z$ g2 D( c) v; `检测那三个是一个anti两个pro,如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路,但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法:' A  k) m9 {( \
1.这个要看哪个快,一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10,而细胞色素C和caspase3滞后的话,那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3, 再多了也没有意义。  K0 F  n4 F0 K/ R9 b1 h3 ~* ]
2.个人认为(因为有将近1年内有看这方面文献了),外源性通路和内源性通路的差别在于,capsase3和capsase8/10, 哪个是上游,哪个是下游。如果激活外源性通路,capsase3是下游,如果内源性通路caspase8是下游,我只是说一般情况,现在研究出了capsase12通路等等,就不在这个探讨的范围之内了。$ B$ r2 L0 A" D3 Z% {0 S2 ?
根据这个判断,你可以用特异性的capsase抑制剂,来抑制其中一个,看看另一个的激活状态是否改变。举个例子,如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态,那就可以证明caspase3是下游。8 L$ u) P: N& ]" @" a
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与,也可以检测这个。- x8 }0 I, l) X8 K- B3 M# c

4 D4 R; M1 b$ z7 v  O' a7 M
  M) e- u- i2 I. E8 W3 m# u2 C! @2 N1 t, R9 y# ~7 M: S
我写过一个英文的东西,可以传给,你不知道会不会对你的想法有帮助

Initiator Caspase.pdf

301.87 KB, 下载次数: 5

已有 2 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 20 + 30 欢迎参与讨论
linlicau + 5 + 10 加油!

总评分: 威望 + 25  包包 + 40   查看全部评分

Rank: 7Rank: 7Rank: 7

积分
1354 
威望
1354  
包包
484  

优秀版主 金话筒 优秀会员 帅哥研究员 小小研究员

8
发表于 2012-7-18 09:19 |只看该作者
检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗?我觉得很贵,而且你前面几步已经能够说明问题了,可以直接进入通路研究了
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
229 
威望
229  
包包
871  

优秀会员

9
发表于 2012-7-18 09:47 |只看该作者
回复 yuhaoze 的帖子) T/ w' b0 K6 e( C8 b: l- e
& e8 e# R3 d# ?, Q* H  y
感谢回复,因为我并不是做凋亡这一块的,凋亡相关的东东完全不懂。
. k  L. |+ H) o8 f; q我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了,所以就想看下是因为坏死还是凋亡,另外,因为现在的样品还有cDNA,所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
% h$ v# p0 f; q: q# MFas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA) Z3 p' ]- A4 `9 O3 _; u, a
NCBI Reference Sequence: NM_007987.2
- ?5 I6 f3 v! x, f, ]8 E# m1 ?! }) j$ F8 X! B4 e8 q2 s$ i! ?
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA0 |/ j; p% D; E, `
NCBI Reference Sequence: NM_207681.2
2 D& Q- Y; W6 ^) |
7 j4 o2 G( E6 l! k8 F7 |  |3 `Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA4 H1 e+ L9 H( O7 J" [5 D# Q
NCBI Reference Sequence: NM_177410.2" h* Z7 q3 Z2 A+ S  v

6 y6 s9 Y3 p. b" y! jBax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA  z: d/ M* v1 o: @
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3# R' w2 y9 O# G9 b. Y8 B, c' ^
" o7 _1 G8 _$ H" X6 U
另外,图中Bclx和Bax标反了,不好意思~
0 g3 g2 F6 O+ y1 r7 D: ^7 r所以,您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢?
$ L& S7 m2 z+ D. ?* U- k( Z
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
229 
威望
229  
包包
871  

优秀会员

10
发表于 2012-7-18 09:48 |只看该作者
回复 希望之光 的帖子
0 m" g+ ^# @" b' F
  ]2 K5 |" d$ Z6 y' a4 _感谢回复,因为我并不是做凋亡这一块的,凋亡相关的东东完全不懂。- S. s9 f: {& S  C
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了,所以就想看下是因为坏死还是凋亡,另外,因为现在的样品还有cDNA,所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
( P9 @! A& t6 }6 L4 b  j另外,图中Bclx和Bax标反了,不好意思~
& M% v! v$ V9 n; e5 e7 D. D另外,您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢?  e( N! L( g: H2 {5 n; i6 U
‹ 上一主题|下一主题
你需要登录后才可以回帖 登录 | 注册
验证问答 换一个

Archiver|干细胞之家 ( 吉ICP备2021004615号-3 )

GMT+8, 2025-6-11 13:22

Powered by Discuz! X1.5

© 2001-2010 Comsenz Inc.