MEF原代 第一次传代

wawj

这次做的ＭＥＦ原代，状态很好，种了六个Ｔ７５大瓶，昨天是第三天，传代，冻了５管，传了一瓶，一传二。奇怪的是，今天看传的那两个大瓶液体变得很黄，飘得细胞较多，贴的也还可以。不会是污染吧，那冻得那几管是不是也不能用了。
  I" d- h! Z- {6 w* ?0 o& g! o分析原因：
6 s: V% M! O. s' k5 [１，昨天传代时细胞量比较多，每个瓶子接种的细胞都比较多，会不会因为细胞比较多，增殖较快，液体一天内就变黄了。
, W" c$ ^- ^. h" D２，昨天传代时上一瓶高糖ＤＭＥＭ刚好快用完了，所以用新配的高糖ＤＭＥＭ，不会是这个液体有污染吧，今天已吸了一点液体放到离心管里培养，明天继续观察。3 w5 k7 K2 K- y5 c
３，以前还没出现过这种情况，今天看到液体很黄，怕是污染，不知道该扔不，就把两瓶细胞都传了，种了一个大瓶，其余细胞扔了，继续观察中，不知道这种处理对吗？请高手指教。* R! l; J0 y' p, E" Q% X6 P' k" j0 _

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wawj

回复 jiefengbing 的帖子
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5 v7 d! Z; [2 A7 x6 y0 M4 ], p0 v* \没污染过  不知道  感觉跟以前飘得细胞不一样  细菌飘起来是啥样

wawj

回复 akxiaoqiang 的帖子- G" u/ a& L  t/ {- Z  Y

  l* I1 t- `$ R6 Z& j咋看呢，求赐教。以前没遇到过

wawj

回复 jiefengbing 的帖子
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今天其实还仔细看了，不像是细菌，但因为没见过，也不清楚。还有一个小细节，今天传代时细胞很难消化下来，不知道有什么提示没，消化步骤都跟以前一样。

wawj

回复 chentian820 的帖子
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3 h2 b$ N* E' v/ ^. u" g' S说的也对，就觉得这只老鼠白白牺牲了。刚冻的细胞能拿出来复苏吗，效果怎么样？想复苏一管，看那些冻得细胞是否也污染了。

wawj

回复 jiefengbing 的帖子
3 z6 p8 u3 q1 h  {7 I2 U) e
: @1 R. Q4 \  W! u' P6 {2 ^被您猜中了，昨天传代，今天一看，液体又变黄了，基本没贴壁的，飘得是很密的细菌，感觉还在动，是细菌吧，还是什么更恶心的污染。我把细胞扔了，昨天放到孵箱的离心管的液体没变黄，但也不能排除有污染，准备重新配液体。冻得细胞想复苏一管看看，如果也污染了，就要重新做老鼠了。又得重来一次，深恶痛绝的污染啊！

wawj

回复 刘森泉 的帖子3 g( _5 n6 m3 s& m

/ d3 P) Y% |/ ]2 ]1 [0 ]  U, N* ~我做的是昆明小鼠的孕鼠，孕13-14天。可能有些人是用ＣＦ－１小鼠，但方法都一样。下面是我的操作步骤，每次分的都挺好，分享一下。
* s! v. F) j" C１.颈椎脱臼处死孕鼠，立即放在预先准备好的７５％酒精里，浸泡大概五分钟。（一般就是从动物房拿到细胞室的时间，下一层楼。浸泡时间不能过长。）
; v! S( N8 {) ~1 Z& D6 u# v２.以下过程在超净台里操作。将孕鼠放在一无菌培养皿中，腹部朝上，剪开腹部皮肤，剪一个小口，然后用手撕开，充分暴露术野。
. c- M) ~8 F0 k8 w3 E3. 用棉球擦一下剪子，酒精灯烧一下，进行下面操作。剪开腹膜，提起子宫，剪断子宫系膜。将子宫放入另一培养皿，滴少许PBS（做原代时ＰＢＳ不需要预热，温度较低对分离细胞有好处）然后进行钝性分离。用两把镊子，将胚胎一个一个拿出来（去除了胎盘胎膜），放到另一培养皿，进行去头，去尾，去四肢，去内脏操作，余下的躯干部分放到另一培养皿，用剪刀充分剪碎后吸到10ml离心管里。5 q7 ^, i) T2 U3 u  w# U. Z5 c4 H* w! [
4.用PBS洗一到两次，然后进行消化，10ml离心管大概加0.25%胰酶1ml,再用ＰＢＳ稀释３－４倍。震荡消化，时间最长不超过5分钟。一般我到3分钟的时候就剩一些絮状物了，基本没细胞了，就立即终止消化，用200目筛网过滤，收集滤液于离心管中，800r/min,5min,弃掉上清，用新鲜培养液重悬，接种到预先铺有明胶的T75瓶中（这样有助于贴壁）。一般两个胚胎种一大瓶。我一般一次能种六瓶。2 s4 V& X/ o; `

wawj

回复 lxm5668 的帖子
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恩，谢谢，冻存的的污没污染我还不确定，复苏了再看看，你这个建议不错，谢谢指导。

wawj

复苏了一管冻存的细胞，没有污染。谢天谢地，冒险用原来的培养液养的。证明培养液没有污染，ＰＢＳ，胰酶也都是好着的。至于它为什么污染了呢，现在看来可能是以下两个原因：# \  F* k) F/ i( s
１.当时瓶子没有完全烤干，还有点湿，污染会不会来自那里。6 n$ E( b5 _; [' T4 @# n* E
２.为了节省明胶，用过一次的明胶回收，下次再用一次再弃掉。当时铺的明胶是回收的明胶，以前都好好的，这次就出问题了。看来以后不能明胶回收了。