MEF原代 第一次传代

wawj

这次做的ＭＥＦ原代，状态很好，种了六个Ｔ７５大瓶，昨天是第三天，传代，冻了５管，传了一瓶，一传二。奇怪的是，今天看传的那两个大瓶液体变得很黄，飘得细胞较多，贴的也还可以。不会是污染吧，那冻得那几管是不是也不能用了。
% H/ d7 i: }& x分析原因：
2 s5 b* G+ i) C8 m8 z１，昨天传代时细胞量比较多，每个瓶子接种的细胞都比较多，会不会因为细胞比较多，增殖较快，液体一天内就变黄了。
1 ]4 t7 m: x- Z. Z２，昨天传代时上一瓶高糖ＤＭＥＭ刚好快用完了，所以用新配的高糖ＤＭＥＭ，不会是这个液体有污染吧，今天已吸了一点液体放到离心管里培养，明天继续观察。( ?; U$ A, {6 {: O7 k) z  g
３，以前还没出现过这种情况，今天看到液体很黄，怕是污染，不知道该扔不，就把两瓶细胞都传了，种了一个大瓶，其余细胞扔了，继续观察中，不知道这种处理对吗？请高手指教。
0 B. Z+ ^7 ^% ^7 n* G" E( R) |: H$ R' m( C

huangcong1988

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) h- C3 _) s# `3 E( h; c  `1 t
跟你分MEF的方法很类似，但是我遇到的问题跟你不一样，我是冻存以后MEF状态就不行了，要么复苏不贴壁，贴壁的传两代就污染。这个问题遇到很多次了，分MEF的时候状态很好，而且我一般是一天不到就能完全贴壁，满瓶(T75).今天分，第二天早上就可以冻存了，但是冻存后复苏就怎么都不贴壁。之前我发帖里面有我细胞的图片http://www.stemcell8.cn/thread-58210-1-1.html

pjlsyz

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% z3 ?. J% }( A6 Z+ A
0 j1 A. ?% B/ _" p) E: s我晕。。。你这东西解压不了。。。

wawj

复苏了一管冻存的细胞，没有污染。谢天谢地，冒险用原来的培养液养的。证明培养液没有污染，ＰＢＳ，胰酶也都是好着的。至于它为什么污染了呢，现在看来可能是以下两个原因：
7 i0 |6 Q* m4 d5 c１.当时瓶子没有完全烤干，还有点湿，污染会不会来自那里。
) O3 f) H8 [, l3 ~! \２.为了节省明胶，用过一次的明胶回收，下次再用一次再弃掉。当时铺的明胶是回收的明胶，以前都好好的，这次就出问题了。看来以后不能明胶回收了。

wawj

回复 lxm5668 的帖子9 K2 T' s3 K0 A9 t  z( s9 x

- W$ r0 `1 U, k5 O2 j1 T  r) f& j恩，谢谢，冻存的的污没污染我还不确定，复苏了再看看，你这个建议不错，谢谢指导。

lxm5668

盛夏季节特别容易细菌污染，防不胜防。细胞间彻底消毒一次，该休假休假，错过这段点背的阶段。

lxm5668

你的PBS或者胰酶有污染的可能。怎么会好好的一下子连冻存的都污染了呢。; b4 U7 O' r* N/ _3 F# d  s
养细胞建议要分批次做。传细胞时密度不要传的一样，有密有稀，这样下一次传代就能分开了，所以有问题时也不至于全军覆没。

lchoxy

看看这个protocol
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wawj

回复 刘森泉 的帖子" P: N' p3 @/ r6 j$ E9 S+ A4 _
; `  ]6 b& l2 v- u
我做的是昆明小鼠的孕鼠，孕13-14天。可能有些人是用ＣＦ－１小鼠，但方法都一样。下面是我的操作步骤，每次分的都挺好，分享一下。- H/ h3 U) U" `) C. n, }: I9 q
１.颈椎脱臼处死孕鼠，立即放在预先准备好的７５％酒精里，浸泡大概五分钟。（一般就是从动物房拿到细胞室的时间，下一层楼。浸泡时间不能过长。）( Q9 S% w1 s- k9 N+ \+ F" j
２.以下过程在超净台里操作。将孕鼠放在一无菌培养皿中，腹部朝上，剪开腹部皮肤，剪一个小口，然后用手撕开，充分暴露术野。
- X' [# K8 J: }8 ~' d3. 用棉球擦一下剪子，酒精灯烧一下，进行下面操作。剪开腹膜，提起子宫，剪断子宫系膜。将子宫放入另一培养皿，滴少许PBS（做原代时ＰＢＳ不需要预热，温度较低对分离细胞有好处）然后进行钝性分离。用两把镊子，将胚胎一个一个拿出来（去除了胎盘胎膜），放到另一培养皿，进行去头，去尾，去四肢，去内脏操作，余下的躯干部分放到另一培养皿，用剪刀充分剪碎后吸到10ml离心管里。. o7 p2 q- Y# l
4.用PBS洗一到两次，然后进行消化，10ml离心管大概加0.25%胰酶1ml,再用ＰＢＳ稀释３－４倍。震荡消化，时间最长不超过5分钟。一般我到3分钟的时候就剩一些絮状物了，基本没细胞了，就立即终止消化，用200目筛网过滤，收集滤液于离心管中，800r/min,5min,弃掉上清，用新鲜培养液重悬，接种到预先铺有明胶的T75瓶中（这样有助于贴壁）。一般两个胚胎种一大瓶。我一般一次能种六瓶。! f% Z2 }7 i+ F; t" g+ P

刘森泉

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  i: Y, {$ f. ]) [0 W, }' g* ~8 U- s+ I; b
什么方法做的MEF，状态比较好。能分享一下吗？谢谢。