脐带间充质传到P5就开始分化了，求解决。

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zhang0194 发表于 2012-7-26 16:54 1 t1 K+ R1 K) o; U
脐带使用机械法分离的。. Y+ F* i, f: G
P0获取量很高，P1-P3形态良好，均按1比3传代，0.125%的胰酶消化。
/ w2 S5 }# C% r/ ~: L8 W# l: Z 但是从P4开始 ...

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关于培养基：& m% p8 \, S/ S7 a% E  s
1. FasGrow添加物和基础培养基混合后，不要在4度放超过一周。
/ {2 t$ g+ K- d! f$ O' t* q& R超过一周后，培养基中的一些成分可能会降解，对细胞干性的维持不利。7 _4 [( g3 E+ L
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关于细胞的获取：
6 E, M: f' V  z, e1. 所谓机械法，是指组织块直接贴壁法吗？还是酶消化法直接获取的细胞？P0细胞获取量大概有多少？是多长的脐带？) u. h3 T* {0 H0 }/ N* A& p5 d
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2. FasGrow需要配合0.05%胰酶使用，大约1min就能把细胞消化下来，因为无血清培养基中细胞贴壁没有血清培养基牢固。过大浓度的酶会损伤细胞。$ D' `! @4 R& n3 e6 U9 I

2 V+ J% U8 |6 V3. FasGrow的传代比例大约在1：8到1：10。过密容易导致分化。不知道你现在1：3比例传代以后，大概需要几天再进行传代？P1，P2，P3的传代时间都一样吗？
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4.  是否上流式检测过不同时期各个标志的情况了？如CD106，等？2 W  ?8 n  f+ T

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* J( \& C. p) B' j1.组织块贴壁法，脐带一般在15CM左右，每次约铺20瓶（75的瓶子），收获2次P1，第一次收获5瓶（75的）P1，第二次9瓶左右，都不一定。+ T+ U) I$ U$ M, l# i/ B. x' q/ i
9 |! r/ f; v1 M+ @. V2.用0.05%的胰酶会不会太低了，因为尝试过 0.25%的胰酶稀释3倍（0.08%左右），发现有消化不均一的情况，有时候出现部分细胞已经脱落，部分细胞还贴壁的状态，后改为0.125%的浓度，每次都在细胞全部脱落了以后才终止消化。- G, v8 c# D% L; F
后消化下来的细胞有杂细胞了。- z% N% J* O! O! _
建议这样：大部分细胞变圆以后就赶紧终止消化。6 m4 a) V' b- D" I! T7 t+ y
对了，你终止消化是怎么做的？; _  D# D$ o3 {8 i  h$ m8 _, n' w' d
这个FasGrow终止消化需要培养基和酶体积比1：1才能终止。
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% [. w3 F2 L! _0 q# k0 ^3.每次1:3传代后 第四天（80小时）左右传代，P1 P2 P3传代时间基本一致，这样高密度视为了减少细胞的分裂次数（认为分裂次数少不易分化），80%融合度就会传代，没有尝试过1:8到1:10传代。( h$ C6 r/ p- {& V' l; @
细胞长得慢了。1：3传代其实可以一天长满，估计是其他操作导致的长得慢，细胞此时可能就已经有些老化了。* L, J/ t9 e( l* b& f5 e* {  O* x
因为接触抑制以及细胞间的相互撞击的原因，长得越满越容易分化啊。" D$ `# J* y- {' {. J( n3 L4 z
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4.上流式因具体原因，只在P1 上一次，确定表型之后就 没有上过了。9 @' D9 Z/ P! x
我们怀疑是培养液的原因，有人建议加小牛血清，没敢尝试，您看呢？1 F- y- : h" {, G, ^) H! Y
别加。血清更易导致分化。
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哎，你可以打我电话不，这样回复太慢了，我的号码是13067794550* N- q, p+ [$ V4 x, ^6 N! P% D8 Y