脐带间充质传到P5就开始分化了，求解决。

zhang0194

脐带使用机械法分离的。
2 o/ m5 v3 k/ i! W7 q: v P0获取量很高，P1-P3形态良好，均按1比3传代，0.125%的胰酶消化。
7 U2 S( d& q8 {/ d' m5 P 但是从P4开始就会出现细胞分叉，变长，立体感不强，但是较少，1比4传代到P5后，大部分细胞开始出现分化。$ q3 J  C; |) ]. g, ]6 [
看文献上说能传到80多代，上流式也没问题，很纳闷是为什么。. W, T& S$ F- A) _$ E
培养液是fasgrow的无血清培养液，求解决。

quge_00

请教一下，
1 k7 F/ W7 y: K- K9 G1、请问你的细胞P0、P1分别在生长密度大概是多少传代啊？: k- y/ v! t) T8 U2 Z
P0局部是在形成密集细胞集落，还是等到完全长满(90%左右)培养皿（瓶）呢？
% o* Q  F4 D: B$ K' w7 m是不是密度过大也会"早老"呢？
4 Q# P9 _4 [. M. t& k- L9 e2、1比4传代是不是可以加大，1：5，1:6？
& [) H. X( p" d% @  M等待高手解答
% G  V/ O2 ]8 E$ b1 E. [  j7 J! i1 N- f# @/ ?7 V

gghywtfz

6 |( L2 e# F. H

zhang0194 发表于 2012-7-26 16:54 $ Y. u$ ~/ i3 \8 `$ p% F
脐带使用机械法分离的。
8 d- W3 U# F7 J P0获取量很高，P1-P3形态良好，均按1比3传代，0.125%的胰酶消化。
# \2 C. J1 K8 h6 G 但是从P4开始 ...

, Z, W! _  L1 `0 S6 p/ ~8 ]" ?7 X0 v2 J. b8 N" s0 c6 E
* W+ T/ q) J# R$ ]4 y5 X0 i
关于培养基：
9 @2 v$ h. G4 q% G9 h1. FasGrow添加物和基础培养基混合后，不要在4度放超过一周。3 H- P& y9 J0 D# q
超过一周后，培养基中的一些成分可能会降解，对细胞干性的维持不利。
0 e1 |# f. Y4 t0 a' y. E# T" h8 X) M% u$ X' @
关于细胞的获取：8 g  |2 _8 b, i; T
1. 所谓机械法，是指组织块直接贴壁法吗？还是酶消化法直接获取的细胞？P0细胞获取量大概有多少？是多长的脐带？
& x& r% _" V0 n$ ]
- B4 W  ^' y/ ?$ `5 D: J2. FasGrow需要配合0.05%胰酶使用，大约1min就能把细胞消化下来，因为无血清培养基中细胞贴壁没有血清培养基牢固。过大浓度的酶会损伤细胞。2 b7 a% }# Z3 v0 z5 b9 `
! d' c/ K% I" A
3. FasGrow的传代比例大约在1：8到1：10。过密容易导致分化。不知道你现在1：3比例传代以后，大概需要几天再进行传代？P1，P2，P3的传代时间都一样吗？) r* y9 r6 C- b8 S9 y/ j
5 n5 v6 n+ k9 T' w3 N3 `
4.  是否上流式检测过不同时期各个标志的情况了？如CD106，等？
2 p/ u6 [! b6 Q# X2 {1 |
: x1 P5 ]5 y/ }) o# F- O9 v; @" U9 x, k% e2 [

yangwy028

加点bfgf试试

zhang0194

- p' U/ q1 u) n  X+ [
/ D9 \9 V2 c% E" y回复 gghywtfz 的帖子
2 o7 M& D* ~3 {
# C3 Q: _; `8 F1 j8 z% [1.组织块贴壁法，脐带一般在15CM左右，每次约铺20瓶（75的瓶子），收获2次P1，第一次收获5瓶（75的）P1，第二次9瓶左右，都不一定。+ \; R) X# C  Y8 |2 _7 H6 F
2.用0.05%的胰酶会不会太低了，因为尝试过 0.25%的胰酶稀释3倍（0.08%左右），发现有消化不均一的情况，有时候出现部分细胞已经脱落，部分细胞还贴壁的状态，后改为0.125%的浓度，每次都在细胞全部脱落了以后才终止消化。. A8 j' ^& v; w
3.每次1:3传代后 第四天（80小时）左右传代，P1 P2 P3传代时间基本一致，这样高密度视为了减少细胞的分裂次数（认为分裂次数少不易分化），80%融合度就会传代，没有尝试过1:8到1:10传代。$ A' q( O! R% D  o/ l
4.上流式因具体原因，只在P1 上一次，确定表型之后就 没有上过了。0 A) ?/ ]. L2 b. X+ U- X0 R
我们怀疑是培养液的原因，有人建议加小牛血清，没敢尝试，您看呢？
0 Z4 o1 `  Z8 B* J2 g4 O

gghywtfz

6 s/ A* R* }7 H' h6 x$ ]7 A3 Y. ^9 x

" a8 j) m% _; M- Q9 ~9 a) p1.组织块贴壁法，脐带一般在15CM左右，每次约铺20瓶（75的瓶子），收获2次P1，第一次收获5瓶（75的）P1，第二次9瓶左右，都不一定。+ T+ U) I$ U$ M, l# i/ B. x' q/ i/ u1 r9 w) x- k( c2 K' _. g: y
2.用0.05%的胰酶会不会太低了，因为尝试过 0.25%的胰酶稀释3倍（0.08%左右），发现有消化不均一的情况，有时候出现部分细胞已经脱落，部分细胞还贴壁的状态，后改为0.125%的浓度，每次都在细胞全部脱落了以后才终止消化。
2 n/ T8 J  J) X& T4 v+ E( |后消化下来的细胞有杂细胞了。! t- h. D, {  T
建议这样：大部分细胞变圆以后就赶紧终止消化。. v0 @& Y- I! Z9 c/ H/ a
对了，你终止消化是怎么做的？2 X, M4 T' `: ?& ^1 S7 s3 ^
这个FasGrow终止消化需要培养基和酶体积比1：1才能终止。
# |; R" w8 u7 z, [' a
: h: d1 Y0 d% u/ ^" @3.每次1:3传代后 第四天（80小时）左右传代，P1 P2 P3传代时间基本一致，这样高密度视为了减少细胞的分裂次数（认为分裂次数少不易分化），80%融合度就会传代，没有尝试过1:8到1:10传代。
& F) ~' L, a% i3 ~% Z6 a细胞长得慢了。1：3传代其实可以一天长满，估计是其他操作导致的长得慢，细胞此时可能就已经有些老化了。! Q  C1 Y' R) g% \2 J; R3 S' K
因为接触抑制以及细胞间的相互撞击的原因，长得越满越容易分化啊。
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9 b. U! Q4 g6 ~4.上流式因具体原因，只在P1 上一次，确定表型之后就 没有上过了。
# p6 e2 ]5 ?: Z0 }! l( k& l& H0 R我们怀疑是培养液的原因，有人建议加小牛血清，没敢尝试，您看呢？1 F- y-
7 j0 |& @  Z4 w4 T: F" }2 r别加。血清更易导致分化。
) ^" H  n1 k; l- _
4 E4 R8 y& f- b4 X& k$ o5 t& \' C哎，你可以打我电话不，这样回复太慢了，我的号码是13067794550" j2 G) D0 [6 r+ m# [

zhang0194

感谢 前一阵子出差了。