脐带间充质传到P5就开始分化了，求解决。

zhang0194

脐带使用机械法分离的。0 S8 r% m! e8 O
P0获取量很高，P1-P3形态良好，均按1比3传代，0.125%的胰酶消化。
" o; Z$ r* u3 \( B; k 但是从P4开始就会出现细胞分叉，变长，立体感不强，但是较少，1比4传代到P5后，大部分细胞开始出现分化。
, H7 G% V7 S' X. U" q! c+ ^ 看文献上说能传到80多代，上流式也没问题，很纳闷是为什么。
- D, q4 D, E4 ?( _. l 培养液是fasgrow的无血清培养液，求解决。

zhang0194

感谢 前一阵子出差了。

gghywtfz

: r, k% I) V# @7 J7 z* n5 H
, B% a% `/ \8 o1 U" K1.组织块贴壁法，脐带一般在15CM左右，每次约铺20瓶（75的瓶子），收获2次P1，第一次收获5瓶（75的）P1，第二次9瓶左右，都不一定。+ T+ U) I$ U$ M, l# i/ B. x' q/ i( Z: C4 N  v7 d: d3 ^4 }) C
2.用0.05%的胰酶会不会太低了，因为尝试过 0.25%的胰酶稀释3倍（0.08%左右），发现有消化不均一的情况，有时候出现部分细胞已经脱落，部分细胞还贴壁的状态，后改为0.125%的浓度，每次都在细胞全部脱落了以后才终止消化。9 @4 G* g6 s/ \1 T- c
后消化下来的细胞有杂细胞了。3 ~. \. t& s9 x2 j/ z9 X5 t) u* q* n0 {
建议这样：大部分细胞变圆以后就赶紧终止消化。0 t* B2 ~5 u1 S/ a. S
对了，你终止消化是怎么做的？
* H: f4 t( Q3 {) q/ L这个FasGrow终止消化需要培养基和酶体积比1：1才能终止。6 t2 I2 g6 s1 ]) V

, B- d3 `) D7 v  g' {7 M3.每次1:3传代后 第四天（80小时）左右传代，P1 P2 P3传代时间基本一致，这样高密度视为了减少细胞的分裂次数（认为分裂次数少不易分化），80%融合度就会传代，没有尝试过1:8到1:10传代。1 u* ~  a2 m( F. q  g5 c/ I3 l% u! R
细胞长得慢了。1：3传代其实可以一天长满，估计是其他操作导致的长得慢，细胞此时可能就已经有些老化了。: J5 e, f. |% K( E
因为接触抑制以及细胞间的相互撞击的原因，长得越满越容易分化啊。3 P% [/ n( n* E( q& d4 p- r
& T6 R7 K0 G3 P1 z3 c9 v$ x
4.上流式因具体原因，只在P1 上一次，确定表型之后就 没有上过了。; I* `8 L, z- N  b: s, t, x) }
我们怀疑是培养液的原因，有人建议加小牛血清，没敢尝试，您看呢？1 F- y- , j) d2 v, f, J& v
别加。血清更易导致分化。
( ?& e6 l9 c1 X4 [% Z
4 S2 o# l! n  |$ P( T哎，你可以打我电话不，这样回复太慢了，我的号码是13067794550
5 S5 o8 S5 |7 X2 q; V

zhang0194

0 K0 t6 b3 o5 E  K
- [5 G1 O9 m3 @+ c( u
回复 gghywtfz 的帖子1 ^9 }4 ?% H2 B) v# z" ^

; j7 f* |% S7 r' d9 i. N1.组织块贴壁法，脐带一般在15CM左右，每次约铺20瓶（75的瓶子），收获2次P1，第一次收获5瓶（75的）P1，第二次9瓶左右，都不一定。3 z" D4 n6 \. V
2.用0.05%的胰酶会不会太低了，因为尝试过 0.25%的胰酶稀释3倍（0.08%左右），发现有消化不均一的情况，有时候出现部分细胞已经脱落，部分细胞还贴壁的状态，后改为0.125%的浓度，每次都在细胞全部脱落了以后才终止消化。# X* z$ J" S4 p
3.每次1:3传代后 第四天（80小时）左右传代，P1 P2 P3传代时间基本一致，这样高密度视为了减少细胞的分裂次数（认为分裂次数少不易分化），80%融合度就会传代，没有尝试过1:8到1:10传代。7 L  I+ Z/ z) y, y* x) E: T( o( }" @
4.上流式因具体原因，只在P1 上一次，确定表型之后就 没有上过了。0 q4 ~' o7 D: F% ^& Q- A
我们怀疑是培养液的原因，有人建议加小牛血清，没敢尝试，您看呢？. x) t: ~/ N" r1 d

yangwy028

加点bfgf试试

gghywtfz

* L2 f+ {+ R* y0 i% h& W, k

zhang0194 发表于 2012-7-26 16:54 2 E2 Y7 G- H/ ^# h" H  U2 D
脐带使用机械法分离的。- T+ f7 u& U* z3 `6 I
P0获取量很高，P1-P3形态良好，均按1比3传代，0.125%的胰酶消化。( P9 A7 a" {9 q+ L
但是从P4开始 ...

3 k/ U& x. a& v# q+ `/ @

3 f5 }3 \: u- a  |5 ]2 }  H! n  c2 O4 Z! y/ Y0 b
关于培养基：
& e2 S3 }7 {9 z* x1. FasGrow添加物和基础培养基混合后，不要在4度放超过一周。
9 R* |7 ]' G: I- P超过一周后，培养基中的一些成分可能会降解，对细胞干性的维持不利。3 A+ {' B6 P& \, t# n- n; ^

% v0 u* ^2 E3 V. `5 T3 c1 U关于细胞的获取：3 G+ O0 j6 R: c4 `3 M$ L  D
1. 所谓机械法，是指组织块直接贴壁法吗？还是酶消化法直接获取的细胞？P0细胞获取量大概有多少？是多长的脐带？
& f: o6 {2 A1 x/ P% W) }
# a3 D( p3 W" o2. FasGrow需要配合0.05%胰酶使用，大约1min就能把细胞消化下来，因为无血清培养基中细胞贴壁没有血清培养基牢固。过大浓度的酶会损伤细胞。' J0 e6 P# F# d

7 b3 s  v- b, t, S. `8 `6 z$ G, `3. FasGrow的传代比例大约在1：8到1：10。过密容易导致分化。不知道你现在1：3比例传代以后，大概需要几天再进行传代？P1，P2，P3的传代时间都一样吗？" X- [, w- {+ \0 t
8 c  Y8 k' G0 \8 t; f: ]
4.  是否上流式检测过不同时期各个标志的情况了？如CD106，等？+ e5 F- ~/ J. g3 X
( K' b3 l$ {8 H2 k; F3 A. w0 [1 T
" \" @8 L4 h; d% H

quge_00

请教一下，& j7 J& z+ [' E6 Q7 K# }* U0 x
1、请问你的细胞P0、P1分别在生长密度大概是多少传代啊？6 B6 z1 R! w6 Y1 @$ z+ {$ m
P0局部是在形成密集细胞集落，还是等到完全长满(90%左右)培养皿（瓶）呢？
4 b: Q& }( D6 {是不是密度过大也会"早老"呢？
; J9 k) q; M, M2、1比4传代是不是可以加大，1：5，1:6？; }5 [6 ^9 P+ ~9 g2 n
等待高手解答
+ b4 V9 p8 Y  j1 X7 i7 c( {0 y9 u( t! o" w, c5 V- R3 f  G0 ^9 y6 W6 j; m