泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

sunflower636

    在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。# ~& w# J( r/ @& k- k
1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）
. {. H6 v8 M9 ~5 C7 z/ _2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。
. E  c/ @: Y; \/ A  O3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。$ J. w; Y; O8 g5 O, |$ q1 }; X" S
4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。9 m4 v) e# e5 B. I" H3 K
5.离心，1300转离心10分钟。+ B0 [1 T/ a- H
6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。
9 o+ \) h- e- ]* i6 m" Q' p7.离心，再离心1300转，10分钟。, A. S% p: f3 {; Z2 O0 `
8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。: n: N0 p& f& n4 G3 l- o& ]
9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。
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以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知 道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

sunflower636

回复 Tim 的帖子& i6 w5 d. |* {; u* z' ~

2 F, n; S- k! J9 A' R那一般用多大速度离心合适呢？1000转？5分钟吗？但是这样我也试过，但是离心管底没有看到细胞沉淀啊。

sunflower636

回复 evial 的帖子& Y2 a% M5 D: T8 H  N# c' R: f: `

" n% h: t5 g8 g( u, H' i没有，我看消化成糊状就直接用离心机离心了。有的说要加血清终止消化，但是我查文献其实血清终止不了胶原酶的消化作用就直接没有加，离心了。

sunflower636

回复 evial 的帖子7 h- ~! D; f1 c# w8 v1 E2 }) W

" q4 ?. m9 S' g2 t1 c+ |; c是吗？那你们都用的是多少转呢？文献里这是正常范围啊。最高还200

sunflower636

回复 loyal 的帖子
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3分钟？？？会有细胞沉淀下来吗？

sunflower636

回复 stemcellmeng 的帖子. J) K- N" C$ N$ D9 U
# M, |! K3 k3 y
800g??那最后一般是把组织消化成什么样子？汤状？之前剪的时候是完全剪碎吗？1mm的样子吗？如果没有剪这么碎会不会影响？

sunflower636

回复 evial 的帖子
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1 J; u. J3 T3 L, _! o5 x' K哦，可能是我形容的不当，应该是消化成汤状，就是已经看不到一粒一粒的脂肪组织那种了。其中的结缔组织完全被消化下来了，所以离心的时候它们搅在一起，我都是在离心后用吸管把它吸出来，然后倒掉上清。

sunflower636

回复 zmm 的帖子
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  k3 |2 @. u+ L' z; S. r( ^嗯，我已参照各位的意见做了些调整，期待我的好消息吧！到时候传图上来。

sunflower636

回复 stemcellmeng 的帖子
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嗯，貌似结缔组织也被离下来了，所以瓶底一堆东西。不过我最后制成悬液的时候用筛网过滤了。

sunflower636

回复 lingminliang 的帖子, M/ q% G. O. K# u
- B. S7 I$ t4 y
一些酶？具体的量是多少呢？