泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

sunflower636

    在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。
; o  V" Q1 n2 ?4 l  `1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）
. H; l" T3 M/ b8 U% X1 ?# c2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。
( b5 U  `4 F/ @6 k- g3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。" h, N7 U3 Q& \" y# n6 J
4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。
6 \& O  a0 R* E) w+ [. f2 h# r5.离心，1300转离心10分钟。) f' K' X- m( Z5 S( P+ C3 r! i
6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。5 k- }6 h) L$ Y, c. y2 g
7.离心，再离心1300转，10分钟。8 f; Y& Z, H' y
8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。
) F) N/ l! k/ O* B$ [  T9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。% F( X* t. [  k: x* M$ Y8 a  x$ G

* k9 j7 d: x) d' u, D: i: H
  \" f. s% a, ?* m; G以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知 道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

Tim

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5 N3 h3 r1 e) L. `9 \/ s- T
7 r3 A$ y8 A" N: u离心的转速比较高！时间比较长

sunflower636

回复 Tim 的帖子/ \) r: l' A8 |( _" s

4 y9 f4 _. K, f7 d& x, I那一般用多大速度离心合适呢？1000转？5分钟吗？但是这样我也试过，但是离心管底没有看到细胞沉淀啊。

evial

4 K7 T( V9 H" f  m' j: s

7 U/ |* T8 O+ O/ `# F$ f/ K你要190太快了，细胞都摇碎了，你当要细菌啊！

loyal

300g，3min

evial

6 M5 u. [8 E+ x
# r+ l5 N. c/ q1 d& r
小于2000转对细胞都是安全的，不同离心机轴不一样转速就没有可比性，一般用G来统一，有时300g相当于1200-1300转。细胞小的话离心时间长一点最长的15分钟也没有问题，一般5分钟可以把细胞离心下来。所以你的离心参数没有问题。
$ [: \' Y2 Q7 E# O5 ?, G+ @: g8 J你的第五步，加过什么东西然后离心么？

sunflower636

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% ]: W* `* u# v9 g' f9 E
; ^7 u! w1 f: k% j' M没有，我看消化成糊状就直接用离心机离心了。有的说要加血清终止消化，但是我查文献其实血清终止不了胶原酶的消化作用就直接没有加，离心了。

sunflower636

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! y, N/ f1 k& \' h+ K9 c9 M1 n, ]* }% z. w/ W5 l) c8 ?0 P( T
是吗？那你们都用的是多少转呢？文献里这是正常范围啊。最高还200

sunflower636

回复 loyal 的帖子; X2 C5 a7 s- v
+ |5 {+ p5 u9 [5 R0 `& {2 V3 W
3分钟？？？会有细胞沉淀下来吗？

stemcellmeng

这个一开始胶原酶消化的时候，其实放在37℃的恒温培养箱中，过个5分钟点到几次就可以，一般这样就可以把细胞消化下来，不需要摇成糊状。应该是你能看到脂肪细胞消化完之后仍然留在上层，但是在下层会有ADMSC的沉淀，这样就可以了。离心的话一般800g即可。还有，你的脂肪的来源部位也有关系，一般是腹部皮下脂肪或者抽脂手术的好一些~