泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

sunflower636

    在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。7 t4 E, }* R# h) t6 K
1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）, m1 P$ q( C8 }
2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。
, G  |- D  E% s+ B( q1 c3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。
# h& b" n( V+ E4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。7 _/ K$ y7 f3 @' ?0 U) I4 W7 N
5.离心，1300转离心10分钟。/ m+ p5 }) P, x% I+ s# E
6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。
$ a9 a$ R' ~8 E1 e7.离心，再离心1300转，10分钟。
  n4 ?% l; W2 i4 m8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。& N) l$ O. [1 G" \
9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。6 `7 p$ E! j) N$ I5 @
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) A6 `* M- W1 l# p% y
以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知 道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

相宜

回复 wiling123 的帖子
  S( X. {5 ]3 ]6 u  M+ R6 G  `1 T5 V3 ^8 L$ u  ^
我消化的时候是一直在镜下观察着，隔30秒就机械的拍打，直到全部脱壁为止，最长的一次消化了6分钟，但是觉得影响不大。当然，只是个人的一些做法。

wiling123

回复 lingminliang 的帖子! G( C2 p5 a: r, `, Y) M4 j$ ?
% @2 a1 [6 e) Q6 T& ?" t
消化倒是好消化，一般30秒就够了，我还觉得是消化过猛导致的呢。你用的塑料培养瓶还是玻璃的？

sunflower636

回复 相宜 的帖子; F; V9 r3 V9 P( \7 N" l- F# A7 f
6 C7 ?: B) K" p4 f- f  O2 m
但我真的是第4天看到的啊，数量很少，稀稀拉拉的。没有计数，因为当时操作的时候不小心浪费掉了一半细胞悬液，所以直接分瓶接种了。

相宜

回复 sunflower636 的帖子9 G. w/ `; E& O1 a/ \7 |

; G6 ?* ]+ e9 [7 O一般48小时之后就开始看到了，到了第三天的时候就基本全部梭形了，4天的时间是不是稍微有点久了？

sunflower636

回复 相宜 的帖子" E) @  i) s1 e" t  a, b- \

" P& b( `" f2 U9 U- F( \" D培养基买的是GIBCO干粉配的DMEM:F12。后来买了HYCLONE的，准备下周用。上周又做了一次，终于看到细胞了，但是数量特别少。貌似长的也不快。第4天才看到梭形贴壁细胞，然后增殖的也慢。

sunflower636

回复 yangwy028 的帖子
* @& G) g: h/ {$ s* s" ?) o# @
: U* ~+ G3 \0 @- f1 E  ^胶原酶用血清中止不了，裂解过后是应该用PBS清洗一下。根据各位的指点，上周做了一次，终于看到细胞啦，但是数量超级少。

yangwy028

每次用酶，用裂解液都不提起终止的事。当然细胞就没法好好存活了，你倒是在每一步操作过程中取样看一下细胞形态和活率不就知道问题出在哪里了吗？

lingminliang

回复 wiling123 的帖子% [9 U4 Z8 M6 |1 P% u2 J7 t( P% N
5 [8 Y" n: U6 p
这个也有， 而且第一次传代的时候很难消化下来 有好方法吗

lingminliang

回复 sunflower636 的帖子" Q' Q6 y. H3 G: I- ?2 a
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