泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

sunflower636

    在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。$ `* z- ~/ S, i1 ?
1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）
) ?$ m7 w5 L% O& k2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。1 }5 b" V: J+ N6 n; s5 p. c
3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。
8 }+ O+ s$ {' Y2 m6 j# z4 `& ]4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。
8 N& x- W& a0 D: \5.离心，1300转离心10分钟。
! O) }$ \* p1 t8 k, i6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。" j, D! c0 O' j+ I9 u' i9 T  ?; r
7.离心，再离心1300转，10分钟。' q! t3 h1 }! h$ \7 K$ d) E6 G8 N" @1 s4 n
8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。. ~6 L2 f+ w% z$ d! J
9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。
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! f# H" \2 f  V4 c* ?以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知 道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

sunflower636

回复 Tim 的帖子
7 F: S! J, Y6 ?% C- j
5 _7 b4 _8 G  O$ }% f5 Y1 ^% Y那一般用多大速度离心合适呢？1000转？5分钟吗？但是这样我也试过，但是离心管底没有看到细胞沉淀啊。

sunflower636

回复 evial 的帖子; L, t3 R  T  D! @$ |7 l8 \
/ p/ c4 A& ]4 L" I; m+ J( u: z4 E
没有，我看消化成糊状就直接用离心机离心了。有的说要加血清终止消化，但是我查文献其实血清终止不了胶原酶的消化作用就直接没有加，离心了。

sunflower636

回复 evial 的帖子
  T- F  `) H/ i
" \+ H6 p9 }) i2 H1 x! Z是吗？那你们都用的是多少转呢？文献里这是正常范围啊。最高还200

sunflower636

回复 loyal 的帖子" K6 y7 `4 J# R4 y: w# i- M/ M  ]
( q0 Y# Q( \$ M" i- S" r
3分钟？？？会有细胞沉淀下来吗？

sunflower636

回复 stemcellmeng 的帖子) f( s, [! z% w

+ B0 b7 x! {2 ?800g??那最后一般是把组织消化成什么样子？汤状？之前剪的时候是完全剪碎吗？1mm的样子吗？如果没有剪这么碎会不会影响？

sunflower636

回复 evial 的帖子. t% D, ]( C" w  T
/ O9 q! S) L$ Q
哦，可能是我形容的不当，应该是消化成汤状，就是已经看不到一粒一粒的脂肪组织那种了。其中的结缔组织完全被消化下来了，所以离心的时候它们搅在一起，我都是在离心后用吸管把它吸出来，然后倒掉上清。

sunflower636

回复 zmm 的帖子7 c- L, [1 ?$ }' n+ ]! y
4 t$ S7 B! F  @
嗯，我已参照各位的意见做了些调整，期待我的好消息吧！到时候传图上来。

sunflower636

回复 stemcellmeng 的帖子( q% C# Z( j. `$ I  ]# {. k

' g' d6 v/ g# W2 Q& f  H) |" {嗯，貌似结缔组织也被离下来了，所以瓶底一堆东西。不过我最后制成悬液的时候用筛网过滤了。

sunflower636

回复 lingminliang 的帖子
" B# |; x+ T8 G4 A8 ?8 j: J3 h/ H9 p! @& M& [* ^) F
一些酶？具体的量是多少呢？