大鼠脂肪间充质干细胞的提取

future007

本人最近做了一次大鼠脂肪间充质干细胞的提取，但是结果失败，在用胶原酶消化完脂肪后，穿过细胞筛的液体中基本没有我想要的间充质干细胞，培养24小时候也未见梭型细胞，下面是我的实验步骤，望大家给出你们的建议，我哪里不太正确。实验动物：六周SD大鼠
$ ^1 L3 F5 P1 I* |实验材料：手术器械、75%的乙醇、PBS(-)、I型胶原酶、200目细胞筛、0.25%胰酶、DMEM/F12、FBS、15ml离心管、50ml离心管、培养瓶、DMSO、滤器、0.83% NH4Cl! O+ m# R/ Y$ ?$ N6 j# U/ z
实验仪器：15ml离心机、显微镜、CO2培养箱9 P. G2 Z# f/ _( }' |$ t+ O# x
实验方法：/ \8 J% W% i2 P, z
1.        取6-8周SD大鼠,脱颈处死, 75%乙醇消毒- A( w+ P5 P! s1 S+ @
2.        取腹股沟部及肾下1 g脂肪组织
. ^! u3 p/ Y; C& Z$ N$ M3.        用含高浓度抗生素血清培养基溶液清洗三次
5 A* J3 N6 e& [% n" \4.        去除肉眼可见的血管及其它组织$ |9 i) t" o& A) m1 [3 g
5.        用PBS(-)反复冲洗3次
  x. i9 J2 b$ o6.        用剪刀将脂肪组织剪成大约1 mm3小块
! C8 J7 |: M% B7 h  s& t7.        置0. 1%Ⅰ型胶原酶中, 37℃消化60 min
& a7 X( y" f! w1 L5 Y8.        用100 mm mesh过滤以出去组织块
1 M1 d+ V" \& K0 Q! l, b9.        用PBS(-)洗涤两次5min 260×g，以完全出去胶原酶0 H+ D5 W/ _& Q* \) B' N
10.        用DMEM/F12+10%FBS双抗培养基培养在培养箱中9 u: W5 R( e' M( ]4 s
首先我自己分析的问题是我的脂肪剪得是不是不够碎，其次我的胶原酶工作液在4度放了3-4周，可能是胶原酶活性下降的原因，所以导致细胞没有消化开。大家请给出自己的判断，细胞图片镜下看就一些漂浮的血细胞，我就不上图了。谢谢大家的帮助" a: d; Y; p! H, C: P4 r' \1 [- j
' B5 ]& e9 {* J

zhouyonhzhan

想问一下你们培养脂肪间充干细胞的培养基加生长因子了吗？

hanchao

谢谢，恭喜。

future007

今天第三天我的脂肪间充质干细胞长起来了，刚开始在镜下就是一些细胞的碎片可见，第三天居然长起来了，希望大家做的时候不要心急，放两三天再下结论。

future007

回复 漂泊的风 的帖子
: M1 N$ f# P7 [0 m& V( y% f$ w1 Y. Y+ A4 ^8 z. V3 b
我查的相关文献最长也没有超过一个小时吧，你消化的是脂肪细胞吗？

漂泊的风

我觉得是你消化的时间太短了，我们是消化过夜，细胞长得很好。