大鼠脂肪间充质干细胞的提取

future007

本人最近做了一次大鼠脂肪间充质干细胞的提取，但是结果失败，在用胶原酶消化完脂肪后，穿过细胞筛的液体中基本没有我想要的间充质干细胞，培养24小时候也未见梭型细胞，下面是我的实验步骤，望大家给出你们的建议，我哪里不太正确。实验动物：六周SD大鼠* L& m: {" [1 ^6 g7 T
实验材料：手术器械、75%的乙醇、PBS(-)、I型胶原酶、200目细胞筛、0.25%胰酶、DMEM/F12、FBS、15ml离心管、50ml离心管、培养瓶、DMSO、滤器、0.83% NH4Cl
% c8 _' \' L4 j* @实验仪器：15ml离心机、显微镜、CO2培养箱" Z  z" ]: X' U/ f
实验方法：- ?6 f+ f' Q" G- Y) V4 D
1.        取6-8周SD大鼠,脱颈处死, 75%乙醇消毒% k% P8 `2 d' O& ?" f* Y
2.        取腹股沟部及肾下1 g脂肪组织
, F% ~7 z4 _- h3 m( i; J6 I* W- c3.        用含高浓度抗生素血清培养基溶液清洗三次3 n3 b; B. H7 f9 V4 |8 B) c
4.        去除肉眼可见的血管及其它组织
$ h1 `0 y7 ?4 s. p- J' F2 n5.        用PBS(-)反复冲洗3次
5 E, D# J  Y' c: ^3 O* Q5 l6.        用剪刀将脂肪组织剪成大约1 mm3小块% I: _0 I9 a- Q% g
7.        置0. 1%Ⅰ型胶原酶中, 37℃消化60 min: V" @0 \+ g6 a
8.        用100 mm mesh过滤以出去组织块( M8 y- Y) x3 \9 N' s& i9 J
9.        用PBS(-)洗涤两次5min 260×g，以完全出去胶原酶
  n6 q- G2 i5 @* R* |10.        用DMEM/F12+10%FBS双抗培养基培养在培养箱中/ r' [0 x' l# B* m5 ]  ^( E
首先我自己分析的问题是我的脂肪剪得是不是不够碎，其次我的胶原酶工作液在4度放了3-4周，可能是胶原酶活性下降的原因，所以导致细胞没有消化开。大家请给出自己的判断，细胞图片镜下看就一些漂浮的血细胞，我就不上图了。谢谢大家的帮助
0 e. x. a+ j9 |! I) p
( |5 _6 J  w0 O5 ^6 |- U: Z

漂泊的风

我觉得是你消化的时间太短了，我们是消化过夜，细胞长得很好。

future007

回复 漂泊的风 的帖子
, {4 G+ R" ?- |2 r" A1 F: W
; w$ X: m6 g. v2 `# p我查的相关文献最长也没有超过一个小时吧，你消化的是脂肪细胞吗？

future007

今天第三天我的脂肪间充质干细胞长起来了，刚开始在镜下就是一些细胞的碎片可见，第三天居然长起来了，希望大家做的时候不要心急，放两三天再下结论。

hanchao

谢谢，恭喜。

zhouyonhzhan

想问一下你们培养脂肪间充干细胞的培养基加生长因子了吗？