大鼠脂肪间充质干细胞的提取

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本人最近做了一次大鼠脂肪间充质干细胞的提取，但是结果失败，在用胶原酶消化完脂肪后，穿过细胞筛的液体中基本没有我想要的间充质干细胞，培养24小时候也未见梭型细胞，下面是我的实验步骤，望大家给出你们的建议，我哪里不太正确。实验动物：六周SD大鼠' T8 Z9 G8 l+ p& H+ l* h
实验材料：手术器械、75%的乙醇、PBS(-)、I型胶原酶、200目细胞筛、0.25%胰酶、DMEM/F12、FBS、15ml离心管、50ml离心管、培养瓶、DMSO、滤器、0.83% NH4Cl
4 j) R/ q1 a. T实验仪器：15ml离心机、显微镜、CO2培养箱
& F1 p- ?) E  S5 e6 c" B2 s, P实验方法：' E# Y: I3 I7 s- A$ Y/ d
1.        取6-8周SD大鼠,脱颈处死, 75%乙醇消毒
3 o5 P- T+ h6 V: x8 [$ ^2.        取腹股沟部及肾下1 g脂肪组织
- F. e" J! @1 a# X% v  c3.        用含高浓度抗生素血清培养基溶液清洗三次- i4 x, O7 P; m" R, `
4.        去除肉眼可见的血管及其它组织
6 k9 ^" O2 S. V8 D4 K5.        用PBS(-)反复冲洗3次3 k; g+ o0 [7 @9 V
6.        用剪刀将脂肪组织剪成大约1 mm3小块
9 j4 h: D: T- Z  e) g+ A; n) i& P1 P, q1 v8 p7.        置0. 1%Ⅰ型胶原酶中, 37℃消化60 min
. I) L7 V: N) Y& E8 U. c8.        用100 mm mesh过滤以出去组织块! P) H% C$ B* C7 |. n! b. D
9.        用PBS(-)洗涤两次5min 260×g，以完全出去胶原酶* b5 S' i5 I8 [! Q( I8 n2 Q
10.        用DMEM/F12+10%FBS双抗培养基培养在培养箱中9 G& F! @4 f1 N4 s  Z7 _& Z
首先我自己分析的问题是我的脂肪剪得是不是不够碎，其次我的胶原酶工作液在4度放了3-4周，可能是胶原酶活性下降的原因，所以导致细胞没有消化开。大家请给出自己的判断，细胞图片镜下看就一些漂浮的血细胞，我就不上图了。谢谢大家的帮助
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9 e7 o4 _4 h1 H" m1 v; o

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回复 漂泊的风 的帖子1 |) D/ j' ~) g7 y/ W

. O! z( W4 s# g$ h! V我查的相关文献最长也没有超过一个小时吧，你消化的是脂肪细胞吗？

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今天第三天我的脂肪间充质干细胞长起来了，刚开始在镜下就是一些细胞的碎片可见，第三天居然长起来了，希望大家做的时候不要心急，放两三天再下结论。