质粒线性化与稳定转染问题

runsong

筛稳转细胞、进行小鼠原核注射、斑马鱼动物级注射时常常有文章推荐将质粒线性化，这样可以提高整合效率。! p! n- o3 T3 p6 ]; i2 K7 h
但我有几点不清楚，还请前辈赐教：
  }5 o! o7 z) M 1、很多情况下质粒并非同源打靶质粒，进行线性化后虽然可以暴露断端，但质粒与基因组并不同源，不满足产生Holliday交叉结构通过基因重组进行整合的条件。请问文章中所说的提高整合效率是通过什么原理实现的呢？6 \9 F- R8 Z5 k* r% {7 q
2、有没有前辈曾经做过线性化与非线性化质粒在稳定整合效率上的比较？到底有多大差异呢？
4 {$ z6 ^8 S4 M  Q# _0 X( }0 F$ k 3、推荐的线性化酶如PacI 、PmeI末端常以连续的A\T结束，线性化酶的选取有什么原则吗？
4 T1 y- A' W- Y9 r4 {) w
: a, j8 e6 q0 a% z6 u# S5 m1 Y
+ F, u* n" p" D% o用户“lifeida” 曾指点道“环状质粒整合位点是不确定的，它可以从任何质粒位点整合到基因组中，而线性化的质粒则不会”我感觉很有道理，再次表示感谢。

weiyepan

我也是一知半解，没有做过系统的实验验证，我觉得这个问题可以从这个角度解释：' I8 S, m! N/ |6 J$ f
1. 产生holiday junction的整合方法一般是由原核的RecA介导的同源重组，是一种消耗ATP的寻找同源区的重组方法，并不适用于非同源重组。, x& ]1 ~7 K- a4 O
2. “环状质粒整合位点是不确定的，它可以从任何质粒位点整合到基因组中，而线性化的质粒则不会"的确是有这样的原因，但我觉得质粒超螺旋结构的影响还是主要的。动物细胞里面有拓扑异构酶，可以帮助自己基因组解旋，但是质粒就不一定能解旋了（原核的聚合酶自己能解旋，所以不需要拓扑酶）。这样的情况下外源的质粒的转录效率（一般能重组的非同源质粒都是有病毒元件，需要先转录才能整合）肯定是线性的高。
  F$ U9 Y' b' n/ C3. 选的那两个酶，估计都是现在流行的质粒backbone上没有的酶才能用，病毒载体比较大，酶切位点相对比较多。

thomas202

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那为什么转293T等一些细胞时不需要线性化？

细胞海洋

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weiyepan

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因为不需要整合基因组表达就很高啊

jddakui

线性化是为了获取稳定表达，因为质粒转入细胞，不线性化，质粒整合如染色体时，其断裂点是随机的，有些断裂位点可能位于你的目的基因中，此情况，筛选基因是正常的，药筛不能杀死细胞，但是目的基因已断裂，不表达蛋白。尤其是悬浮细胞。选取的酶一定不能破坏启动子。