关于mES N2B27 feeder-free serum-free培养

vegetax4132

; i' w- @, f9 v

/ |- Z$ D. }. x2 M) S- ^  q最近想建立mES的 feeder-free serum-free的培养体系
, p  ~9 {# v$ l6 X& y. |结果发现细胞传入N2B27培养基中大量不贴壁。但克隆球都是活的，再移到feeder上也都能长起来。
: j9 L. q7 h. r& ~大家有遇到过这种问题吗？
$ ^  u2 A- F* H& A$ U8 W* L, f4 {/ P
我用的培养基:
' {/ ~: L% a' v8 ^3 T, VN2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗      
$ Y/ z# K6 W. c8 s9 v& o" F2 |8 P看YING QL 06年的那篇protocol中没加非必须氨基酸和丙酮酸钠，我也就没加。: A; r. b6 F8 y
* V% W) l  E  U, v- v
在N2B27中， 图中圆圆的小球基本都没贴壁：! |# ?0 R) o9 E7 Z) d+ J3 M4 j

2012-8-8 21:45 上传

下载附件 (110.31 KB)

# O7 E, }! E* W1 a4 d将图中小球移入feeder  血清中，就都贴壁了：
: s7 U% W1 \" r" j3 e$ L5 R

2012-8-8 21:41 上传

下载附件 (250.41 KB)

zmm

回复 vegetax4132 的帖子
; @/ T5 r6 e5 [- ^, R
3 ~4 b9 ]9 B) a  l/ i5 x你需铺些基质，克隆就会贴壁了。

vegetax4132

回复 zmm 的帖子$ w  @$ o4 ]1 x: V! q- v
0 {) ?$ Z+ _0 _  f( |1 R  L7 J9 g% C
基质？  是什么啊？   

frankieisme

回复 vegetax4132 的帖子
; A* {& a1 J% ~. i
7 J8 a! P# g2 t有一种"matrigel"

vegetax4132

回复 frankieisme 的帖子
1 ~4 }( R% t- P9 {( w3 _3 L* h
, ~+ m- g0 i0 Z7 x' u  G; [哦      是一种比明胶更好的胶吧？   听说过   4℃铺  37℃会凝固   是这种吗？

zpzp0312

) I3 s' L- r+ ]
0 r$ @0 ~! Q& Q! w其实你这种转移到饲养层上的细胞球也已经有分化倾向了
0 y4 g; Q' i& l# s! |另外，matrigel我们使用过，只能说效果不明显& {& o3 j. ]7 p) `, J5 C
当时我们使用的是ESGRO feederfree medium- g( F; G9 t. K" x" U3 U2 \, p3 T
效果和楼主的这两张图相似2 f4 V8 ^" N  E2 U
在matrigel上面也不能很好贴壁，有大量的细胞球似乎和基质有些黏连，但适当晃动就会飘起来9 @7 r, g0 `. P$ }
转移到饲养层，就可以发生贴壁，但是也有分化倾向- R* I7 ^0 Q8 t
但如果直接使用饲养层培养添加这个培养基，细胞生长状态还是不错的
6 D, ^" {" ~5 r, l" ufeederfree效果不满意

zmm

回复 vegetax4132 的帖子
, X$ o0 T3 M; B) I' g2 B5 j! Q7 Q% Z, X: s% `
明胶等都可以

vegetax4132

回复 zmm 的帖子& C4 V+ e$ S5 C

! i  |0 v3 s7 [我是铺了明胶的，
/ a! f' E4 k$ z. m. s2 X$ _最近听说再铺一层血清就能贴壁了，试了下真的基本都贴了，不过这样克隆长的很慢了。好几天天都不见长大。。。

vegetax4132

回复 zpzp0312 的帖子
) U; F9 v; n' ^" D& w0 b1 e! n9 g7 A0 O& S4 L7 z5 \
谢谢，    不过ESGRO也是一种类似N2B27的培养基吗？      
* n( c! q6 c- \! o* \( {$ ?6 D我用N2B27+LIF 加上feeder，  发现克隆形态不好，feeder有大量死亡   

zmm

回复 vegetax4132 的帖子% x$ k7 J% i& w) g" F
' j- ^2 J' Y" m5 p+ ^
血清也可以。因为不含血清，所以克隆增殖较慢