求助免疫荧光大神

托斯卡纳教父

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' V( I# |; h4 p6 N$ B2 V9 D+ X小弟做了小鼠大脑冰冻切片，然后染了色，目标蛋白位于溶酶体上，但本应有荧光的样品却没有。7 t! e+ _; ?, }0 l8 Y- c' M# w$ r
一抗：polyclonal sheep anti mouse IDUA' I' e) s$ d+ W! s5 B$ {0 Y
二抗：donkey-anti-sheep IgG (1:500): ^: t  Z1 a1 X& B
block: 5% donkey serum+0.3% Triton1 q( m1 Q' Q! F8 E- R6 A9 ~7 Q
+ c4 K, a* n# }$ v9 k  i
我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100，效果都不是很好! p: \8 w: A8 U

8 w7 R8 _$ ^- c9 C7 v0 A0 I求问 我该怎么办6 w: N% [* M: q9 [" L% N* }$ K

2 N6 ^9 G7 x/ ?3 n5 j: S

托斯卡纳教父

我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理
! k7 h6 M$ g( c4 Z# p+ R8 U( V新手上路 求各位提供宝贵意见

wiling123

一抗是哪个公司的？提高抗体浓度一点都没有改善吗？更高一点可以试试。- c; F# I0 o: F3 h" V

3 P2 |8 [0 f& A+ S1 B5 p) Y4 z我个人觉得，固定很重要，不知道你是用冰甲醛还是多聚甲醛。换一种固定看看。

托斯卡纳教父

, u8 e# O" a7 L' J2 R" j& V9 I+ T! n" P- V9 j
回复 wiling123 的帖子- G. D& }) q/ y# H, t* b$ Y
4 G/ }4 a4 o2 q! L) t1 b; n
一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标，另一种抗体染了效果很好，应该不是固定的问题吧
$ v8 j7 d1 e6 ~, ]/ p7 L9 I: l0 S% T1 c! N
1L的图是提高浓度到1:100的
) f$ H# [/ g; \& k& r7 t) d/ M4 h1:500的图在这里：

wang3033

1.封闭液中加入0.5%的tritonx-100,试一试！
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小猪快跑

二抗的浓度呢？还有拍照要快，有的荧光消失的很快的！

evial

真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多少？

托斯卡纳教父

evial 发表于 2012-8-19 10:42 / X% ^% P: g& ^; O
真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多 ...

0 \* U2 D6 k% G5 G: w2 V: _- p是free floating sections with a freezing microtome.# I) x1 l5 i! j& Q
取材后4%paraformaldehyde过夜，30%sucrose 大概48h.
7 L' Y' ]; Q( ^0 V. P" m4 k0 S5 L6 v1 ?  N" v. ]
我是做的荧光双标，另一个一抗染色效果不错。

托斯卡纳教父

回复 小猪快跑 的帖子
1 V4 O: Z7 i+ H2 r. Z$ U: g
* g* B; |) Q3 W( F" p. C8 ^2 s2 L二抗1:5006 m$ R$ d9 d4 p% {$ M1 [- B+ B& N3 Q: V$ ]
我觉得拍的速度够快了

runsong

我的感觉只要一抗好，做起来就比较容易。" [7 P) F! Y% _( \: O7 t- P
你做冰冻切片的话样品不要先固定再切片，应该先冰冻再切片，然后短暂固定一会。这样的话对抗原的损伤小。
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