有养过RAW264.7的高手吗？

一转身的距离

如题，请教，为什么细胞冻存后复苏不贴壁？是不是RAW264.7对胰酶的作用很敏感？但是为什么在培养时又会觉得很难消化？
# @+ p7 M4 z5 W1 f: E6 w2 ^才养这株细胞，急求解答！

一转身的距离

3 d! q8 Z8 t. p) _  P! {. F3 R0 P2 l: S" N: _3 d) T3 ^* o7 n
回复 katysong 的帖子1 n6 i) |; H8 d/ C

- S8 U1 P, F4 Q: L( Q+ w+ A0 ]我们原代培养的是腹腔来源的~

myboluo

回复 katysong 的帖子3 B% a+ a$ D. {9 z; S& V1 u4 T

. q; g+ Z6 P, W) ^3 ]) G3 a% N我们也是两个小时贴壁，不过这时候还贴不牢，一吹一晃就掉了，要想贴的牢就需要7天左右

eley

强烈建议不要用胰酶消化，Raw对胰酶非常敏感，而且很容易分化。
( ~( U1 C" o2 j" E; l% F还有就是在用之前的培养基一定要预热。
* [3 W" _; G% {/ y  w2 X! u/ H我使用的是1640，现在细胞长得很快& U8 [5 X! T6 F+ k. P" P2 i
每次传代的时候，用枪把细胞吹下来就好，不要消化。

katysong

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我们一般是用加EDTA的胰酶消化的，加酶之前用预热的PBS多洗几遍，至少两遍吧，然后加酶消化，一般3分钟以后细胞就可以变圆了（当然也要看你酶的活性，刚开启或融化的胰酶效力会好一些），可以再等一分钟，不要直接把细胞吹掉或拍掉，可以先吸掉胰酶后用PBS洗一遍，防止EDTA对细胞以后的贴壁有影响，1：2或1：3传代都可以，看你原来的细胞密度；
) A# D( a, |  q+ m复苏的话就只要注意快速融化，以防冰晶对细胞的影响，说难养其实还是挺好养的，要有信心，祝好运！

katysong

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不知道你养的小鼠巨噬细胞是来源于哪里？骨髓还是腹腔？但两种巨噬细胞贴壁的话都不用太久，2小时后就开始贴壁了，当然我们一般是用过夜后再用的，不过确实增殖比较慢，除非加因子比如：M-CSF

andyz0922

我们的实验室都是 用PBS 吹打的  没有用胰酶消化的   RAW 很容易脱壁

一转身的距离

谢谢各位的建议与宝贵经验，很受启发！非常感谢！

shy8610

raw264.7相对来说，还是比较容易复苏的，要求是冻存株当时是健康优秀的，复苏的时候，尽量选用进口一次性耗材，包括管子和移液管，培养基单独配，不与其他细胞混用，PBS的要求一样，我们实验室十分介意raw细胞是否受刺激，消化情况也可以看出细胞的状态，一般来说，37度消化2分半，就可以镜下看出细胞变圆，然后可以用拍打的方式将细胞拍下，绝对比等着胰酶效果好，另外注意防污染黑胶虫

一转身的距离

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: m. ^5 p% ~0 _8 H5 i) W2 y  V/ d; S
没有试过用预冷PBS浸泡，因为它贴壁牢，所以没想过可以用这种方法。可以试一下。