亚硫酸氢盐测序法

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多能性基因（Oct4、Nanog）启动子甲基化水平检测：亚硫酸氢盐测序法
% Y- w$ J! E, V0 UDNA提取后如何处理

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0 Y2 F3 u: x3 T+ h# D" d% g) j" K. {/ X0 c8 |8 O8 K; l) b+ T! c1 y
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 3 f2 n4 \* j% U3 w8 ]9 S# y, L
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。9 z  E9 [# _+ ?' e0 N! u8 h
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
& ?3 T: k1 e6 u" ^) L3 {  M2 l2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； ; E9 i+ _7 v5 ]' V0 {9 g  `
3： 42℃水浴30min；$ L+ i7 H( H" a
水浴期间配制：, p7 K" H" R, i% D( W1 u: Z
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）9 {: x( t- Z6 {. I- Z8 q1 s
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
$ ~2 m3 q5 B# |& n5 @6 C7 r/ p" e- i6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
/ @. e, f" J7 ^0 |0 P0 U  q% ]7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。1 n3 b) Y5 x, o' O3 \, ^. }
8：50℃避光水浴16h。& j( \2 f2 }- `) {) H& F
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
/ P+ Z( f6 X0 H7 j: e. M第三部分 修饰后DNA纯化回收
3 O& u# j  J- m  L% `6 D第四部分 修饰后DNA用于PCR* z4 v! w9 d8 I" _! B2 P
第五部分 PCR产物的凝胶回收
2 h! X4 \7 V8 x. s$ a6 B这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。
, w1 X6 {" e- s# ]# d第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选:Promega的试剂盒6 I# ?8 w7 n- n" s% Q" K
最后，联系测序公司送测序。