亚硫酸氢盐测序法

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多能性基因（Oct4、Nanog）启动子甲基化水平检测：亚硫酸氢盐测序法
  t2 K, K$ }5 r) P+ m& m; SDNA提取后如何处理

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0 l' R6 ^6 ]0 B9 T0 Z第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA * e) Q7 v  j: D: s# T: Q0 |
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
. [0 A3 n: ~$ o1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
% i, y/ f; a1 r& Y* F( r2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； + N) Q& M# _, W8 x0 A- ^7 [
3： 42℃水浴30min；
! c: M* r4 C5 r水浴期间配制：
" d3 [$ _+ D" s+ H" D4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）# s0 |8 k5 V, |  G5 y2 x+ f9 b
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。- `. a% F4 S. I6 y
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 6 b, m, t% I. M
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
5 ~- A; h5 X; }1 S# q& P2 [9 U8：50℃避光水浴16h。
  X. q9 }8 J2 f5 g" C3 a  Y* p9 D一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。4 U# r, ^. Q7 |/ k
第三部分 修饰后DNA纯化回收& r7 D0 Q" H( R% x. ~8 K4 j% p
第四部分 修饰后DNA用于PCR+ H& Y& T$ Y: r5 `! c7 G0 }6 m0 q
第五部分 PCR产物的凝胶回收. R6 y" g& V) ?* ^* B' A4 G
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。
# F5 |& V" S7 ~+ n1 [第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选:Promega的试剂盒; u$ w+ w" f& e1 |  V; \& m' S
最后，联系测序公司送测序。