亚硫酸氢盐测序法

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多能性基因（Oct4、Nanog）启动子甲基化水平检测：亚硫酸氢盐测序法
9 S/ N& J( z6 |8 ^$ hDNA提取后如何处理

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6 i5 J7 z" H  J  c6 s8 G8 q( u$ N$ R  @1 h
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
" O9 s& a  N* l) b" c' m如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
4 n, A) o8 @) J0 C9 W1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；6 l) d7 e0 J; S1 p0 x* z
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； ( ]( n& `; ~4 p% H- M7 `# a
3： 42℃水浴30min；" b7 b, @3 x0 V0 M+ ~  w* @3 A$ ^: c( b
水浴期间配制：6 `7 V& c6 d, ]
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
. z) f9 u  V5 o$ V2 Y2 E5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。; M# B2 b5 i& t! Y1 e" U
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
* l4 V' j0 u  }9 K1 ~: A7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。1 s) u  _6 ]6 Y. Z% Y, i" F
8：50℃避光水浴16h。" r/ m: ~: t' S
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
& H9 c- \- R' T& \, r0 E第三部分 修饰后DNA纯化回收. N8 S1 O5 p9 o* B) Q3 u/ z# H+ k9 z
第四部分 修饰后DNA用于PCR
) {( j" s. L  d6 p  c# P第五部分 PCR产物的凝胶回收
* X6 D$ X. T3 G这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。2 ?) P1 U2 K6 j, s- l
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选:Promega的试剂盒
! D' a1 u5 n. }; `# C0 m最后，联系测序公司送测序。