western 目的片段50-54kb，而内参就43kb，如何切胶。

willing

有办法解决这个问题吗，谢谢各位了。

echowdk

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0 U1 V" x" S+ O; l3 G, H& n6 _; O0 T- z9 R: N, Q/ N
不能切胶的话，只能上两套样了。

BNJN

跑两块胶就好了

王坤

不知道你的样品充足不？跑两块胶耗时耗力，还不如在膜上做文章，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。6 x" Z9 S  A, Z) C
  如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可信度高些。9 X" u. k( l# r% k3 U
  

BenHantun

找一个有50kd的maker，跑电泳，跑的时间长一些，然后一起转膜，一般100V，45min就好了，然后在50kd的MARKER 处将膜切开，分别孵育抗体就OK了

BenHantun

转45-65分钟

lazyworm

为什么要切胶呢，你可以孵育完目的蛋白的抗体后再孵内参啊。

chentian820

其实这个问题很好解决。你先用target抗体孵育一抗和相应二抗，显色以后将膜strip一下。stripping buffer配方：62.5mM Tris-HCl PH 6.8, 100mM beta-巯基乙醇，2% SDS, 50-70℃孵育30min即可。然后再用内参抗体孵育。

shy8610

楼主可以先孵育目的蛋白，然后strip，然后孵育内参，反正内参强，怎么弄都行

miRNA

stripping即可...