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小弟向版主及各位PCR高手求助,帮忙解答,谢谢~ [复制链接]

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楼主
发表于 2012-9-12 12:39 |只看该作者 |正序浏览 |打印
本帖最后由 细胞海洋 于 2012-9-12 22:29 编辑
! B* d1 F; _* w3 ^6 x) d
- K$ ^1 v" C% A版主你好,我想请你帮帮忙解决下克隆的问题,我们最近在克隆Lats2(ORF:3129bp)是Hippo pathway的核心基因,但是一直都克隆不出来,设计的引物是从NCBI上找到其mRNA,然后在取了他的ORF并选取其首尾的两端20bp序列定为primer并加了保护序列6bp和酶切位点6bp。可是各种PCR的条件和程序都试过了,可结果都没有目的条带,而出现很多杂带,找不出原因。求解啊!感谢!
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小小研究员

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发表于 2012-9-13 21:04 |只看该作者
本帖最后由 细胞海洋 于 2012-9-13 21:04 编辑 . U3 T4 V; X9 Q3 a# k

' [: x0 s& z' Q3 P* Z回复 caifranklin 的帖子
* {, B9 E* X" F5 X: |- K2 _
6 e' e3 i( c6 u! O) `* s可以的
( X5 s: s/ l* s( z( ~9 k
: S3 X& ]) \; l! [) K你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样
8 h- T5 h- x# D+ K/ W: d  v( j# A( W4 f3 i& G1 i1 O2 o, I
他上线会有提醒

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发表于 2012-9-13 11:55 |只看该作者
好像是我的权限不够啊,不能针对性的回复各位哦,版主求助!

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发表于 2012-9-13 09:06 |只看该作者
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回复 caifranklin 的帖子- D( ^* G: A. _1 r: V9 p! ?
4 q& _7 |# d4 G2 d: M
你可以试试两步法PCR,不用设退火温度。其它都一样。
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小小研究员

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发表于 2012-9-12 21:26 |只看该作者
回复 caifranklin 的帖子0 l8 [1 P# a8 o' @

* e7 H9 C; G# g5 h你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样( C8 j* q' e- _" O5 l" C, p
6 o% o8 Y7 U5 k  R  g" H
否则他会看不到

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地板
发表于 2012-9-12 21:01 |只看该作者
pcr 无非是两个主要问题,pcr 条件和引物。你好象是引物问题,如果你确信酶和条件没问题,只能在引物上下功夫了。要说服老板换引物。引物现在很便宜,多试一试。 要不把你要扩增的序列放在这儿,让各位高手看一看。; G4 z( l# l! t6 u
pcr看是简单,但有时就是不出来。我们科曾有一个罗马尼亚姑娘,设计了20多对引物多没有work, 后来换了一个日本人,两队就出来了。
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报纸
发表于 2012-9-12 20:16 |只看该作者
同时感谢版主的鼎力帮助!谢谢!
$ P" F/ ~2 D3 K& Z! c

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板凳
发表于 2012-9-12 20:15 |只看该作者
感谢各位大神的指点,我们实验室的引物都是这么设计的,之前师兄也是,他的20多个基因都批出来了,可惜我的碰上了麻烦。我也提出过换引物,可是老板坚持说是我们使用条件没摸清楚,酶也是换过了最好的NEB的了,各种酶都试过了。现在能批出条带的已经是唯一能用的酶了。其他的都批不出东西……blast的结果显示,引物的特异性明显很差,二聚体的几率很大,但是老板就是不想换引物……悲剧啊,在此条件下,各位还有什么高招没?跪求援助啊!不胜感激!
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藤椅
发表于 2012-9-12 14:34 |只看该作者
首先,你这个primer设计也太简单了吧,现在市面上不是有很多引物合成软件吗?比如那个vector,primier,oligo等等。而且对于你设计出来的引物有很多要求,比如其GC含量以40-60%为宜,引物对应模版序列的Tm为72最好,选择引物二聚体及发夹结构能值最低的。引物3’端一定要与模版完全配对,不能出现3个连续碱基,末端避免使用A。
4 b% ~+ A7 m- t( C; d8 U还有,我不知道你的目的区域有多大,当你的目的区域小于200bp时扩序要加大,引物尽量向两边移,要挑两边特异性最好,Tm最适合的。
" u; o1 A+ o, j最后,一般PCR时在条带最下面可能会有两条杂带,一个是引物二聚体,还有就是dNTP。如果你还有其它杂带,那只能说明你的引物特异性差,p出其它部位的片段。
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沙发
发表于 2012-9-12 13:13 |只看该作者
回复 caifranklin 的帖子
  P& R. S# B% {- M& O+ F5 |( x: ]8 O0 g. e
我看到你的帖子,你的目的好像就是PCR Lats2这个基因的mRNA是吧?前段时间我们实验室刚好做完这个实验,我们也遇到这个问题了,假如这样的话就必须做RT-PCR,而且我们做的时候发现买的盒子里的Taq酶有问题,死活都PCR不出目的片段,你可以试试买新的Taq 酶。至于你所说的杂带,你可以再Primer blast中看看你的引物的特异性。
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