脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下; o% Q7 |5 S6 Y$ S# }+ |: Q
我的实验步骤：
+ S3 {( P8 B* ?5 z% Y& ?  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。* t8 }: c4 I5 d) h; X+ w* \- ^% E
  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。
- ?7 Y0 ?6 M3 R# Z  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。6 k- E, m* G) I1 A
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。
- p$ r# A, e1 X$ P2 D! P' _% e  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。; n4 l2 x2 ~& V  l9 z# k/ j
  6、弃上清，加入全培培养。. K. S  Z) I" g* l
5 b& [5 {; `! M+ D( m
按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

loveless

回复 amberma 的帖子
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+ ^; z" r( z; B6 v: H我用的是I 型胶原酶，30min。

loveless

回复 willing 的帖子- A% `( l' I2 k7 p

  a. K4 ]8 G. P  W2 N( @9 }有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

loveless

回复 都市青蛙 的帖子
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8 ?! y% Q2 g/ V) Z我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

回复 tangyihan 的帖子
0 u' r- r; e1 k& x' h$ @* Q1 w$ |7 V# o% @! b# c0 |
请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

loveless

回复 stemcellmeng 的帖子
6 w) X, X1 F  ^6 b; ~$ t$ ]+ ?; A+ h) R) h4 |# ]' ~5 H( v2 c/ L
   我用的是Balb/c小鼠，胶原酶加1ml，因为脂肪量只有0.2ml。我的培养基是买的Hyclone的高糖培养基。

loveless

回复 都市青蛙 的帖子
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胶原酶我也用过0.25%，但是还是没养出来。我用0.1%的养了人的脂肪干，方法步骤跟养小鼠的是一样的，就是脂肪量用了10ml，能养出来。可不知道为什么养小鼠的就是养不出来。

loveless

回复 xiaoyurly 的帖子& _( j) X2 k2 T! @4 k( @: u! e" L  Q
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周龄大小对ADSC没影响么？我用4~6周的balb/c很难养出来细胞，换成2天大小的SD乳鼠用同样的方法能养出来了，第2天就有好多贴壁的了。难道是balb/c小鼠脂肪干细胞少？
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loveless

回复 cartoonyang 的帖子& t; F! Q* ?1 H- y6 G

5 K, q# s$ ?) t( T; o) fbalb/c的用组织块贴壁法也没养出来，SD乳鼠组织块能养出来，不知道是为什么。
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loveless

回复 xiaoyurly 的帖子2 A0 ^8 r; |) x( z& i

. {' J5 Y; O& r! }) g! d% `1 S密铺快传？要是快的话，细胞还没长到80%。我原代的时候按1:1原瓶传的，P1第2天还感觉挺好的，就是数量不多，想让细胞长到80%传代，结果第4天就老化了~~