脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下
3 h( Z" m6 d1 c2 H# j: M 我的实验步骤：$ W/ D3 L, V/ e" R% Z# w
  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。
; r+ b( O/ Y! ^2 ^6 e  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。, f1 b6 Z. y: X! K
  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。. G1 Y4 l4 s( y5 _7 E* e  _5 B
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。7 t% Y2 Q: Y+ O3 o
  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。0 |' t1 w/ m4 k5 ~2 ~
  6、弃上清，加入全培培养。
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' s' n# T! g6 d: u  Z按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

loveless

回复 amberma 的帖子
' v7 p- \! T$ c; Y! M
7 h6 h' K7 W' C我用的是I 型胶原酶，30min。

loveless

回复 willing 的帖子2 ?# [+ w& {! `; l% J, p9 y

( {( ^; H, b" M& y( j! \( c有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

loveless

回复 都市青蛙 的帖子6 S+ S) w& I: @- X% z( o
2 ^$ Q0 ?; f2 r) i. A, Z# X4 @
我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

回复 tangyihan 的帖子! s) s+ Y3 D; e1 e  l& U

1 e) c% W$ d/ h& {" L, _/ u9 |/ S请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

loveless

回复 stemcellmeng 的帖子* f3 k) r4 ^7 n4 x4 O* ^: a" ?

& e+ e7 P9 P( [4 F5 ?9 j   我用的是Balb/c小鼠，胶原酶加1ml，因为脂肪量只有0.2ml。我的培养基是买的Hyclone的高糖培养基。

loveless

回复 都市青蛙 的帖子
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4 d6 V8 j' P( f" x& v胶原酶我也用过0.25%，但是还是没养出来。我用0.1%的养了人的脂肪干，方法步骤跟养小鼠的是一样的，就是脂肪量用了10ml，能养出来。可不知道为什么养小鼠的就是养不出来。

loveless

回复 xiaoyurly 的帖子
) U& b8 L8 U! t. e; n0 i6 y( k/ T) ^2 C0 Z' K+ J
周龄大小对ADSC没影响么？我用4~6周的balb/c很难养出来细胞，换成2天大小的SD乳鼠用同样的方法能养出来了，第2天就有好多贴壁的了。难道是balb/c小鼠脂肪干细胞少？9 s0 o: \6 t1 }& F- c- O$ H% C

loveless

回复 cartoonyang 的帖子% ^1 a1 @2 |, ?1 o$ p+ P3 }+ O' L
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balb/c的用组织块贴壁法也没养出来，SD乳鼠组织块能养出来，不知道是为什么。
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loveless

回复 xiaoyurly 的帖子& P% W& c9 J" y

& S- `( G9 g( W# Y5 q- _: e: I! N密铺快传？要是快的话，细胞还没长到80%。我原代的时候按1:1原瓶传的，P1第2天还感觉挺好的，就是数量不多，想让细胞长到80%传代，结果第4天就老化了~~