脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下
1 g1 }7 U6 r0 U3 e 我的实验步骤：% P3 ~6 d! E( e/ q1 p4 i7 a
  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。
6 d" R7 \$ h8 U" |- F" X  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。+ r! D; L% j- Q& O' p: @+ x
  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。& P1 l: b( `9 m
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。
3 s- j; N: R) V! k: q6 I% Y1 D  W2 K1 J  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。+ G# Y1 B* ?4 A: X" B9 s" B
  6、弃上清，加入全培培养。9 N" k# J* n$ U: [( n& W
9 J% P+ u$ ~& V- F' p
按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

amberma

几号胶原酶？如果4号 太温和了 30min 时间太短) E& t1 T( @& J
试试胰酶10-15min
5 R$ T2 Z2 K5 n

loveless

回复 amberma 的帖子
: U$ i) E: L6 f7 q9 j* Y! C$ S6 C& N, H3 G$ J0 N; F3 N2 p1 d0 k
我用的是I 型胶原酶，30min。

willing

是没有细胞长，还是什么情况？

loveless

回复 willing 的帖子
$ O4 Y; C8 G5 D' \/ g; C, B0 t
# N, K. s) F: K$ G有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

都市青蛙

每次你能取到多少脂肪组织？
: P) s6 H& r+ Y' T% ]& F/ `% R有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

tangyihan

回复 loveless 的帖子, E8 U& x" h/ P8 ^
$ \1 b' E5 Q1 s8 y& j( e& c- L
可以考虑:
/ z8 r& G8 e( ^1.用0.2%胶原酶。
$ ^6 U- o, E1 F% d2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。# k5 `6 A# p" g7 i( m% F8 R
3.离心后用100um filter 过滤。$ I0 @$ y0 k' ^5 e2 }
4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。
" A0 d- T$ r% X5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。5 _: S4 `6 Q; r! ~$ q, o6 D9 m
" X2 u9 a2 F, C( C
祝你成功！

loveless

回复 都市青蛙 的帖子; g( c0 F4 ]; I( |, Z* \1 u
: Y: ?! S# A4 f- K3 c8 c) |( b
我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

回复 tangyihan 的帖子8 C8 W# Q$ I( d  g) u3 i" ~
  ^5 i5 v  y+ ]. Y  a
请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

tangyihan

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. X4 \, a' @) B& f4 \9 ^2 _, R/ B& q3 K2 |; |* Z# k& [/ A; R# E
用0.2%的胶原酶消化