脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下
0 J. r7 a3 E' L3 b" O 我的实验步骤：
) s. h8 g. J' e# i  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。
! u$ ]: N( @* G! W* O+ c6 I9 M: @8 k  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。3 K1 Z8 V- W' \) E
  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。) g6 q2 u  p1 N+ V
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。
- [& v) {/ c/ w+ ~) a8 s. @- t  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。  A' {) R: k; D2 x; F# x+ G' z
  6、弃上清，加入全培培养。
7 s: J8 I% j2 C5 a& X
1 k$ T# @$ P8 M按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

amberma

几号胶原酶？如果4号 太温和了 30min 时间太短8 h) X/ k4 x3 J  x+ T; h  Q
试试胰酶10-15min
  A) T& g  a5 l+ |; v

loveless

回复 amberma 的帖子% W' A! V6 h% k9 c5 U. p
  G# M7 ?8 f, j) z: C
我用的是I 型胶原酶，30min。

willing

是没有细胞长，还是什么情况？

loveless

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, L. }. V. s$ Z3 @- b2 e2 }! `3 L1 {3 I" C( D
有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

都市青蛙

每次你能取到多少脂肪组织？7 a3 ?, w* _  e; ~
有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

tangyihan

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" M9 F7 g1 j: Y* q8 A% `
, K8 u( x: n- N9 z可以考虑:# E5 y! z2 b! Q( k  A
1.用0.2%胶原酶。
/ W% ]1 v$ ?2 Q) E2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。
! `6 m; F# q% u: J1 j, |  q0 [3 x! e3.离心后用100um filter 过滤。. B! Q8 M$ _& u) E- v! o
4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。
" u8 g: l9 A! U5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。
. }% |; l* a) X9 q
* s' H7 u' C: g. E祝你成功！

loveless

回复 都市青蛙 的帖子+ R; j* K" a: J
  t& A, W# `% L9 ~- D% k
我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

回复 tangyihan 的帖子% ], ~3 r! A& k' C" [- S3 _( B% _/ s
4 w# b2 |1 N( G( ]
请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

tangyihan

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7 L4 w- f) @4 C
' n' d$ F+ {, g* m5 p用0.2%的胶原酶消化