脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下* _3 h' N# k6 l% ]7 p% l. N( q& {, A
我的实验步骤：1 o1 y, _; c% x! X! s; @. k
  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。, {9 G6 [3 h' Y+ S! i
  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。* ~; N; J- l. a% K
  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。( M$ h" `9 M8 ?. _; u! M
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。
" @9 G$ h+ l1 }+ P2 e' R; r  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。! j/ o* X& P) l; X
  6、弃上清，加入全培培养。  \7 G3 X4 a) Y0 Z
( [- Y( K% i: ~* g' P7 q: _
按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

amberma

几号胶原酶？如果4号 太温和了 30min 时间太短
% i1 t/ s' t3 w7 F试试胰酶10-15min  |% X* T/ o; c7 m" _

loveless

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- y# O$ N& H" M% K7 N% g) m  S& B
我用的是I 型胶原酶，30min。

willing

是没有细胞长，还是什么情况？

loveless

回复 willing 的帖子
, \. ^8 I. I  @8 r/ p$ d2 v( k2 I8 E
有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

都市青蛙

每次你能取到多少脂肪组织？! q: |3 u" l, h; h4 \. y; m0 p
有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

tangyihan

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" k5 g( f/ c( i* J$ S- _" o
) w" O1 X/ D* d9 A可以考虑:" V* B/ ~5 c. m! z" ]
1.用0.2%胶原酶。* b; S# I2 A" B) v
2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。
* W4 v. t! ]. r1 Y9 A& O6 i3.离心后用100um filter 过滤。. Z0 R; l: \9 V6 X9 ]4 \3 d$ n
4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。: E! M5 p1 ~# p$ J
5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。2 k  i& T) |8 k8 a) D$ j
8 M6 s. b) s4 R+ K0 ~7 X: I
祝你成功！

loveless

回复 都市青蛙 的帖子/ u, g  x! @5 Q4 a5 i; S( p

' f" x' o* ~  _  ]我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

回复 tangyihan 的帖子/ ~6 V7 _7 _3 g; D
7 n. q, _( |( V% H
请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

tangyihan

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3 V* v: `$ L' e# `- z3 s" ]$ ^3 Z$ h- Z/ I2 L, Q! R* I& d  |1 W
用0.2%的胶原酶消化