DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。0 L; k# j/ L( s( b: b
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基( s$ W$ L6 R$ R) {
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时$ g9 c! C- ?. I6 b! m3 l
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
0 {# u3 J4 K, w8 c5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF( c$ ^- h9 U+ z' \! s
6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF2 ~2 T) f. K3 d
7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天
1 W7 s  I0 j. B6 S9 q3 N不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？/ P" M6 P+ L: ~5 T
诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？
! n$ p3 D% l: I& k6 u流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.% Y0 d* C6 ^2 d7 J, N
请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

yubin083

就我的经验，DC一般不会是梭形很长的那种细胞，如果你想证实，可以做FACS检测其phenotype

星火燎原

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1 M" O9 f; J, ]8 S  j; {! {# C9 L4 A* B
不用就在原瓶就成，加tnf之前不用吹

hwlightning

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4 g6 o1 s6 A  E; Y, T; _" @! S/ {. h& f7 c, u
最后加TNF诱导成熟的时候，要不要把细胞吹起来加入另一个培养瓶再进行诱导？？？+ G' P% A- H7 d$ \1 I

星火燎原

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/ t* @6 c% W* x) x$ J7 u  q! Q( }. V1 ]
有的，诱导也不会是同步的，出细胞的时候吹打一下

hwlightning

回复 星火燎原 的帖子& B( F4 {* q1 t% N; V% l6 y
0 W% X  ?% n1 i( D% g( q
我觉得贴壁的细胞有可能也有DC细胞吧？？？？

星火燎原

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( ?* C. W7 v) V& ?3 C- ^6 ?) ]- I! s; |# H7 u3 z
我觉得尽量别去动它，成熟过程中

hwlightning

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2 R; I- Q. H! y" o
6 B: c* \% W: h1 a- y; i% z) M3 I我看贴壁的细胞是那种很细长的那种，比直的梭型，两端很细长。; [+ Y/ W  ^8 w$ `8 f
细长端有的又有很多分枝。  K4 N1 D/ V  S% H# g
再请问下加TNF-a刺激成熟时要不要把贴壁的细胞吹打起来, w; ]) f, d  {% c2 P9 X
就是最后一次加因子要不要吹打细胞？

hwlightning

回复 星火燎原 的帖子- \$ S2 W- G7 ~& ^! l

2 @/ _' ~5 z( a# a那不是对因子的需求量很大，可不可以先把细胞吹打下来离心后加完全培养基重悬刺激成熟？

星火燎原

回复 hwlightning 的帖子9 Z" z# x, f( ]) a: W) H, Q
( W, v! ^3 v1 P' ]# `# ^
换液肯定损失细胞，可以不用换液，补培养基同时补加因子