DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
, m/ j5 [' J8 ~. G5 N2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基
- A- K7 G4 D# t8 b0 `# p7 p3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
7 D( T. |3 ~6 p9 `: Q6 h  X4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
( X, o6 u) b( h. F5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF
" h0 f$ l2 U0 y. `, J6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF/ U: T) _! k% v! S
7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天
0 f* M. n9 `9 v% }1 c/ W$ Q不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？
; x" Q: Q* k$ S3 j" V诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？4 I# Q/ ~+ w, k0 X2 o9 B- j
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.$ @  x2 z# D: E: \" o. K# T
请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

yubin083

就我的经验，DC一般不会是梭形很长的那种细胞，如果你想证实，可以做FACS检测其phenotype

星火燎原

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$ B  K) d: y- P' M! w( W
不用就在原瓶就成，加tnf之前不用吹

hwlightning

回复 星火燎原 的帖子! g$ O, m. P0 O+ J4 Q

; M* ~9 d+ _" k% L( s, s" x最后加TNF诱导成熟的时候，要不要把细胞吹起来加入另一个培养瓶再进行诱导？？？
  t& u/ L/ {7 d4 T

星火燎原

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4 n7 o0 X3 c$ G; O
* u. R$ d) B: D# \" ?% {5 l3 i有的，诱导也不会是同步的，出细胞的时候吹打一下

hwlightning

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6 o" R8 M4 h  n) H( }/ {  O- o* U' o  ^  }( N  ?9 B) j
我觉得贴壁的细胞有可能也有DC细胞吧？？？？

星火燎原

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) [9 {) ]& ]; Q1 t" y6 }3 w" w
" [( ]! h% O( ]/ t3 Q' J- X我觉得尽量别去动它，成熟过程中

hwlightning

回复 yubin083 的帖子" z6 k5 B5 d4 E% j4 Z1 e

  p. N% G) f* Y: @/ d/ h  o- @" V我看贴壁的细胞是那种很细长的那种，比直的梭型，两端很细长。
# u' q0 H# z1 I8 a  T细长端有的又有很多分枝。; K" T9 X% }5 z3 U6 t
再请问下加TNF-a刺激成熟时要不要把贴壁的细胞吹打起来
4 ?7 A+ X5 n" d+ z4 B( F9 c* ~就是最后一次加因子要不要吹打细胞？

hwlightning

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( B* h9 p6 l, X1 n; c8 [( @0 r2 l+ N; w8 D2 D
那不是对因子的需求量很大，可不可以先把细胞吹打下来离心后加完全培养基重悬刺激成熟？

星火燎原

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5 V! M1 v$ `( d* Y! B6 b8 [( c  W' Y/ f( S
换液肯定损失细胞，可以不用换液，补培养基同时补加因子