DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
# Z2 L7 S: D* f  D5 Y# J2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基
* l0 A: T5 j" S3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时5 p' C7 l* H: X8 e! j1 J3 x
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基) F( s4 i+ \% x6 Y
5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF5 G' a/ W; j0 v: L" D
6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF
+ ^3 i0 a  W# {! o. w' Z7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天
* N9 e! O4 b( F, E" ]4 g3 G4 k不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？7 a7 r7 }; U# X
诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？  \9 _* p* b* i( C
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.
6 q8 K, h1 B4 X" u. k3 o请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。6 H6 o  N% A& K9 ]% K  M  b) `$ g' S% b
     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
8 _$ @3 o1 g5 v" j0 ^" J0 ?     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
  |4 s4 \) y# t  c9 D$ z      临床试验不是很了解，同问。

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。
: Y& F) r+ ^7 v- q1 F) A     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
) b* V1 X3 {0 @: w8 a/ q     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
7 T% w/ r% D0 V) q% E6 s" u9 ]      临床试验不是很了解，同问。

yubin083

想问下这样培养出来的细胞中有macrophage吗？如果有，大概有多少比例？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子
4 Y- f2 \5 u0 Q% B; X
  n8 h. ]2 n. f4 Y3 P我今天看细胞的时候发现有很多贴壁的细胞，但是贴壁的细胞也有很多树突状。

透明之蓝

3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
8 x7 I" L% i* _1 _0 } 4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
% K* R1 P3 j& v; z
3 s1 D! G/ h: c  s弃掉培养基要注意，格外小心，轻轻操作！！要不细胞会损失很多！！$ \: \' B; F; T+ g. a0 [. e$ Q
关于其它问题，同问！！

yubin083

回复 hwlightning 的帖子
# a: ?9 Z2 `2 U% p
+ }# _) ]5 {4 r/ a* \0 M2 R样子有树突，不一定是DC，有一部分可能是巨噬细胞，这种细胞有小突起，而且贴壁，比DC还牢靠

yubin083

关于血液中单核细胞的分化为Mφ和DC
: G) |, O9 o8 d$ G# B这种关于这种DC（表面CD1+，CD11b+，CD14+/-）国际上是有争议的，至少已故ralph steinman教授就不认可

yubin083

诚然，从人体血液中培养获取获取DC亦然成为不少researcher的研究方法，我仅仅想了解依靠这种方法获得的DC的纯度到底有多少（排除淋巴细胞后），其表面CD表达的情况？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子4 ?" w8 w( C; L3 j
' t: F2 ?; f! Z; L2 K
是不是成熟的DC细胞是悬浮的细胞，
1 N; R- l4 U; j0 {$ ~# E我最近看我养的DC有很多悬浮的，和贴壁的，如果我半量换液的话会不会损失掉很多细胞？
5 ?) H1 s- A* A* Y