有分离培养SD大鼠骨髓间充值干细胞的吗？

live861215

我现在做的是SD大鼠，刚开始做，我是用的是percoll液进行分离的，第一次没分离出来，第二次我配了1.090,1.077,1.067,1.055的梯度percoll分离，效果也不好，我每次用一只两周龄的SD雄性大鼠，能分享下你的经验吗？你采用的是什么分离方法。
% w! A; `8 u! _  I: y4 q+ Y; U先说下我的方法吧：2 w3 A: l$ ~- I% G6 Z% D5 x1 Z9 r$ E
首先准备两个培养皿，分别加入无血清低糖DMEM12ml与6ml；然后大鼠脱臼处死，放入75%的酒精中5分钟，取出后，取大鼠前后股骨放入第一个培养皿中，并去除肌肉，转入第二个培养皿中，再用5ml的注射器吸取培养基冲洗骨髓，再收集第二个培养皿的细胞悬液于离心管中，1000 rpm离心15分钟，去上清，加入1ml无血清培养基重悬细胞，再在另一离心管中分别加入梯度percoll液（由离心管底部至上分别是高浓度到底浓度的percoll 2ml），最后将1ml的细胞悬液加在percoll上，3000rpm离心25min，出现一层乳白色的薄层，用1ml的移液器吸取这层细胞，将其加入到一新的细胞培养盘里，加入10ml含10%FBS的低糖DMEM中，于37°，5%的二氧化碳培养箱中培养。
& e% H5 h% T' t- {; H6 c1 @希望指教！# _+ ?; {% b7 p2 r
谢谢细胞海洋的建议！

86964109

你说的效果不好指的是什么？是细胞量少还是不纯呢？我们用过Sigma的淋巴分离液Histopaque-1083

live861215

回复 86964109 的帖子2 Z% m7 ^* v# N4 O3 d# Z
3 E* B- y5 `& I* J# s- w! J# T
细胞少，长得慢，杂细胞也较多，你用的淋巴分离液Histopaque-1083是怎么分离的？结果如何？

86964109

回复 live861215 的帖子  z9 u3 ?2 v# w, T$ a8 x

: ^8 b! v  k0 j; x超净工作台中剪断股骨和胫骨骨干两端，显露出骨髓腔，用2 ml注射器吸取L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，吹打制成均匀的细胞悬液。& x; R+ O( b0 \2 f  }5 T' T
将骨髓细胞悬液缓慢加于HISTOPAQUE-1083分离液液面之上，3000 r/min离心30 min。7 O( Y2 I# h% ]% C  p4 A
离心后悬液分三层，取中间乳白膜层，1800 r/min离心10 min。
: |. p1 D' \, d+ _0 c用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮细胞，接种于6孔板中，培养瓶置于37 ℃、5％CO2饱和湿度条件下继续培养。# l7 N. x9 C0 D9 w6 @9 L1 ]
我们的长得也有点慢，主要是怀疑培养基不给力

wanglijuan_1989

我们用的是全血培养，我觉得效果也很好，培养液用的αMEM，原代之后血清浓度可以高一点

wanglijuan_1989

错了，是原代血清浓度可以到15%
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星火燎原

杂细胞多了，原代首次换液的时间提前