神经干细胞固定问题！在线等答案！

Tim

我今天上午做了个神经干细胞固定！固定完后细胞像被胰酶消化一样！感觉很差！不能用来鉴定了！大家帮忙看看我的问题出在哪里？（1） 吸取培养液。
2 Q  S' G/ ?/ Q8 `( z        （2）用PBS洗了一次！时间1MIN$ K2 a' B: E* k
          (3)  加4%的多聚甲醛0.5ML，超净里放置20min，吸掉多聚甲醛
" ?5 T  C% J+ {( g         （4）用PBS洗3次！每次1min，
+ L$ ^9 f5 M' n1 K# X  ~
' A7 y, O/ C# [" j: U. {多聚甲醛不是我自己配的。我这里有俩种多聚甲醛（1）4%多聚甲醛   0.01M      (2)4%多聚甲醛   0.1M   
& G  e7 ]) F- C; O* A$ g我上午用的是(1)多聚甲醛          这俩甲醛有什么不同吗？？0.01M    0.1M指的是啥？？
% y' L; Z0 k4 H
# Z5 ^$ |; L+ S   

bibottll

回复 Tim 的帖子* D; ]& D- Z+ d5 G7 G# ^  y( H

! b6 _/ A$ }, J9 F- Q1 R1 W* S. X没有啊，我觉得是你的多聚甲醛有问题吧，你自己重新配了试试么

Tim

回复 bibottll 的帖子
8 J$ c$ w: L1 L' }' _% V
- c) p" i7 O9 S; F0 v对细胞的影响咋样！回缩了吗！？、

bibottll

还是用自己配的放心啊，我一直都用4%多聚甲醛固定，没有出现楼主的问题啊，至于固定的时间一般是15—20分钟，但是我有一次固定过夜了，第二天染色也是没有问题的

zb_ming

回复 Tim 的帖子! _7 p1 x5 u+ y% U0 N
* {2 e0 v0 n7 z5 Z
放时间长了，肯定有变化，所以如我所说，咱们养细胞的应该处处小心，大意不得，任何一个不起眼的失误都能造成全盘皆输。! I7 z( v, B9 }: ~) N
所以，出了问题我一般是一步一步的去排除的，不好凭空说是那一部或那几步出错了，因为失误很有可能是我们想不到的或者容易忽略的哪一个不起眼的步骤。  e2 J9 y, l1 C% |  s
既然你楼主怀疑ph值就测一下，人家做过了没问题，我们自己做的时候不一定就不出现问题。8 Z% P6 e3 V9 c
所以实验要用事实验证来检验一切，这样更有说服力！祝福楼主早日成功！

Tim

回复 zb_ming 的帖子
! i1 S& J& [$ }0 s+ O5 D
3 O  g- F- G7 ?9 x我现在想想应该是多聚甲醛的PH值有问题！

Tim

回复 guoye0210 的帖子+ {% i; A3 F0 y& ]
( p% a9 c+ i8 P- z1 w! y+ y
现在实验室只有以前配的！但是我同事前几个月还固定过没啥变化！

guoye0210

另外，加triton，BSA,一抗，二抗之类后洗涤一定轻柔，1~2遍即可

guoye0210

4%的多聚甲醛是否现配现用？本人觉得5——10min即可，PBS轻柔洗涤1~2遍即可...效果佳！！！

Tim

回复 ljs 的帖子7 v/ C* r0 h: d* A- q
7 q; J, M+ r1 `+ I2 w  r. {
回答（1）固定完后境下可见细胞回缩！像酶消化过后！
5 {! e3 B) N5 e- }7 X' m* c) _  q9 C       （2）固定完后细胞回缩很厉害！成片的向上飘！贴壁的没多少了！
4 {& p% b7 J0 |3 T, J       （3）实验条件就有多聚甲醛，还有共聚焦。还不是我配的！4度固定这个真不知道。至于时间我们老师说20MIN就好，具体我也看了看文献！
  j9 r0 y) W+ q; z, k, b# Z4 e          3 y3 r" V, D. z6 s# @
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福尔马林固定方法能具体讲讲吗?还有在4度固定的原理？