神经干细胞固定问题！在线等答案！

Tim

我今天上午做了个神经干细胞固定！固定完后细胞像被胰酶消化一样！感觉很差！不能用来鉴定了！大家帮忙看看我的问题出在哪里？（1） 吸取培养液。
4 R% Q- ?8 c4 p  p4 ~        （2）用PBS洗了一次！时间1MIN
; U& D" q$ Q1 m9 ^0 v4 m. i# O! o          (3)  加4%的多聚甲醛0.5ML，超净里放置20min，吸掉多聚甲醛9 f# i+ A# r: k3 J
         （4）用PBS洗3次！每次1min，
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/ m5 P9 |6 |& ]多聚甲醛不是我自己配的。我这里有俩种多聚甲醛（1）4%多聚甲醛   0.01M      (2)4%多聚甲醛   0.1M    & d( p5 O) X2 L/ G0 J% b( O8 K5 l6 M6 L
我上午用的是(1)多聚甲醛          这俩甲醛有什么不同吗？？0.01M    0.1M指的是啥？？
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# t! I- n" u: F) @   

zb_ming

0.01M和0.1M指的是pbs的浓度，一般所说的1×PBS即0.01M PBS，多用它来直接配制粉末状的PFA至4％，10×PBS即0.1M PBS，其浓度不同而已。养细胞包括固定细胞做实验，其影响因素很多，因为实验环节很多，所以楼主楼主要十分细心才行。出现问题了要一步步排除。楼主用的多聚甲醛浓度应该没问题，但不代表它就真的没问题，因不是楼主自己配的，放多久了是否能用只有楼主自己去确定了。当然还要排除细胞的状态没有问题。

Tim

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5 H3 ^( z+ F/ @: F! B5 `
* g; }2 r: O' ]7 d& k9 @之前一直是在负20放着！37度水浴锅融化！！多聚甲醛没见任何异常！细胞固定前状态还可以！本人认为可能是时间20min有点长？？？老师你认为呢？
) Z+ i4 S2 w( B2 @

ljs

1.楼主认为细胞状态很差，依据是什么？: e/ ?0 A; C3 n% Z2 ~
2.楼主如何就认定固定后的细胞不能用来鉴定？既然已经固定了，为何不试试去鉴定呢？
0 a4 {0 m8 ~3 f( T' ?+ K3.楼主为何用多聚甲醛来固定细胞？为何在室温固定，而不是在4℃固定？为何只固定20min？, f/ Y, _* ^; |; |; E" P
4.福尔马林固定液本人认为是固定效果最好的，多聚甲醛是用来做电镜共聚焦的，多聚甲醛没有福尔马林固定液性质稳定，效果更不能与福尔马林相比。

Tim

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8 l4 z& n1 R) K0 g9 b9 V2 t5 {  |7 M' s7 ^1 D, U( u" J
回答（1）固定完后境下可见细胞回缩！像酶消化过后！
. T0 K+ C: g: I5 l0 K  F3 t       （2）固定完后细胞回缩很厉害！成片的向上飘！贴壁的没多少了！1 i! N& j; p; e8 V
       （3）实验条件就有多聚甲醛，还有共聚焦。还不是我配的！4度固定这个真不知道。至于时间我们老师说20MIN就好，具体我也看了看文献！
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福尔马林固定方法能具体讲讲吗?还有在4度固定的原理？

guoye0210

4%的多聚甲醛是否现配现用？本人觉得5——10min即可，PBS轻柔洗涤1~2遍即可...效果佳！！！

guoye0210

另外，加triton，BSA,一抗，二抗之类后洗涤一定轻柔，1~2遍即可

Tim

回复 guoye0210 的帖子7 W) a: f. H; A4 u" z& H' F; J
3 x  K$ X* u/ }
现在实验室只有以前配的！但是我同事前几个月还固定过没啥变化！

Tim

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) l+ {' K& n* _' ^: b) w3 N6 O0 n5 G, _+ C, T0 z
我现在想想应该是多聚甲醛的PH值有问题！

zb_ming

回复 Tim 的帖子" e6 s7 Z. `7 I* ?9 J1 {
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放时间长了，肯定有变化，所以如我所说，咱们养细胞的应该处处小心，大意不得，任何一个不起眼的失误都能造成全盘皆输。
9 J9 z3 v" ~4 e$ R& V所以，出了问题我一般是一步一步的去排除的，不好凭空说是那一部或那几步出错了，因为失误很有可能是我们想不到的或者容易忽略的哪一个不起眼的步骤。  ]0 E/ l7 {! c" e& I
既然你楼主怀疑ph值就测一下，人家做过了没问题，我们自己做的时候不一定就不出现问题。- h6 u$ @* m' }' o: d1 x# i
所以实验要用事实验证来检验一切，这样更有说服力！祝福楼主早日成功！