免疫荧光技术的疑问

如来的观音

最近做荧光检测标志物表达情况时，用到了不同厂家的几个不同标志物抗体，上边推荐的protocol略有不同，所以有几个疑问：
  o% f; O: G+ _& H& h1、4%多聚甲醛固定到底是在常温下还是37℃？
7 K" G; w! }& Q. @2、封闭和通透能否同时进行？有的说先通透后封闭。（同样也有温度的疑问）6 R& o) E& ^' d' o
3、通透液有的用Triton有的用Tween，有什么不一样的效果吗？
7 t; k+ ]. F5 V. R8 i9 @4、还有稀释一抗到底是用封闭液还是用PBS就行了？* v2 s3 s7 d4 N- Z  ?
5、孵育二抗是同样也有温度的疑问（室温OR 37℃）。

qilan2012

1.固定温度没有多大关系吧，我们都是取材后放到四度固定...免疫荧光效果也不错，固定的目的是阻断组织细胞死亡后的自溶反应，与多聚甲醛温度关系不大吧，个人偏向常温，37度本身就会加快细胞自溶过程。总之，感觉温度没多大关系...) c/ J- E4 l+ w0 R% s$ s' A& n
2.两者都是提高膜的通透性，原理没什么冲突的地方，同时进行可以节省操作步骤$ R. y* V, V- d4 ?' o3 k. C* e% f
3.两者都是膜通透剂，强弱不太一样，没什么大的区别$ h, R- \3 ~8 P$ i! j" n# T
4.一抗封闭我们这边也是两者都有人用过，结果没有多大区别，用封闭液是考虑到在一抗过夜的过程中继续起到封闭的作用，不过没有什么理论依据，因为一抗的特异性很强，前期的封闭应该能起到很好的效果9 L) s- y0 Y  W2 u- G3 l! t
5.孵育抗体的问题主要影响反应的快慢，我们二抗一般孵育两个小时，常温，结果挺好的。按别人的说法是长时低温，例如一抗过夜效果会比较好，短时高温效果会差一些，不过我们试过一抗37度两小时，结果也可以..* `4 G2 S' K$ z; d2 T
你的这些问题个人感觉大部分是实验室操作习惯不同吧，如果不放心的话，考虑做两两对照观察效果...

ljs

1.固定通常是取材后放到4℃固定，没有那个条件室温固定也是可以的。病理实验室没有37℃固定的。
- X# L. m8 d. f: n  r2.triton（曲拉通）的目的给细胞打孔，让抗体进入细胞内部，如果抗原在细胞表面，没有必要加这个试剂。通常是先打孔，再封闭非特异性抗原，封闭的试剂通常是在加入一抗之前。如果楼主用心，可以在这个步骤加入一个平行的对照试验。加入一个切片即可看到对比效果。至于温度，曲拉通在10℃左右都可以打孔，所以不用担心温度。封闭温度也在室温进行，无需37℃，在37℃下封闭的结果有可能得到相反的结果。
+ u" j! F1 [* O) U, k3.triton的打孔作用很强，tween试剂在免疫反应中应用不多。根据操作者的实验结果而定，如果细胞内的抗原显色效果不强，可以考虑曲拉通，打孔后的显色效果非常好（曲拉通是有毒试剂，对眼睛尤其有害。操作时小心）。: h+ u  D$ @- A7 C, ~8 C1 Z7 k
4.一抗的稀释液2者作用相似，结果没有多大区别，个人偏好PBS。理由是封闭液其实是蛋白质溶液，与一抗还是有竞争作用的，如果一抗的稀释倍数很低，在用封闭液，可能影响实验结果，出现假阴性的实验结果。这个楼主小心了。
: f' B, o% h- o+ @4 H5.37℃孵育抗体会影响反应速度，冬天，二抗通常在37摄氏度下反应1个小时；夏天在室温即可。如果楼主不放心，无论季节，都在37摄氏度下反应二抗是正确的。4 i0 P/ D$ \8 \: e. h" F
6.以上的实验条件都属于抗体反应的优化，楼主根据自己的情况来调节把握。

liuzhihong

不同的厂家做的东西使用的情况不同，所以就不一样啦！个人见解啊！

如来的观音

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2 U: S! q; |) i! o1 L2 L. t* p
+ f5 _' W4 G# g: g回复很详尽，谢谢

如来的观音

ljs 发表于 2012-11-5 18:54 . G0 s1 m6 k- o
1.固定通常是取材后放到4℃固定，没有那个条件室温固定也是可以的。病理实验室没有37℃固定的。
' E$ a% X. p6 U0 v+ P2.triton（ ...

  z* T& r! a" q* j! I
回复很详尽，谢谢

amphioxus

其实免疫荧光的操作步骤不同的实验的不同的，效果也有很大差异。做免疫荧光先通透还是先固定，或者还是通透和固定一起进行；温度是室温，还是37度或4度过夜不同实验都是不一样的。首先，这些方法不同人都用过，都做出来过。其次，说到个人的实验，看你做什么东西了，比如做GV卵可以37度固定45min，随后1%BSA封闭4度过夜；染囊胚时，可以在室温进行通透，和封闭一起进行。最好能在文献上查到相关实验步骤，看人家怎么做的，这是最好的方法，若是在找不着，就必须做预实验，摸索合适的条件。祝你好运！